葛根芩连汤治疗肺动脉高压的作用机制研究

李松林，韩 雪，李文娣，姜 山，王 旭

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

肺动脉高压(Pulmonary hypertension，下简称PH)作为高血压疾病中的一种，此病可诱导右心衰竭甚至引起死亡的一种临床疾病.在20世纪90年代初临床上还没有针对性的药物，直到近些年才开发出一些药物，但价格较为昂贵.而在不断发展的中医药技术过程中，体现出了多种优势，因此，在临床上也越来越重视对中药制剂的使用.

中医认为PH的病因以“痰浊”、“气虚”、“血虚”、“血瘀”较为常见[1]，而其病因关键为宗气不足为本，痰瘀阻滞为标[2].在现代临床中药方剂中，寻找可以有效治疗PH的药物是更加安全有效的策略.葛根芩连汤出自《伤寒论》，其中以葛根为君药；黄芩、黄连为臣药；甘草为佐使药.该方本用于治疗表证误下之后表邪未解、汗出而喘之证.但随着现代研究的不断深入，发现该方适用于“湿热”、“痰瘀”、“血瘀”、“郁热”等证，所以在治疗高血压疾病中发挥了显著的疗效，具有较高的开发前景.因此，本研究通过网络药理学的方法来探讨葛根芩连汤对于PH治疗的分子机理，为揭示葛根芩连汤的药理作用提供参考.

1 实验方法

1.1 葛根芩连汤中活性成分的筛选

应用中药系统药理学数据库和分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索葛根芩连汤中四味中药的活性成分，将筛选条件设置为口服生物利用度(oral-bioavailability，OB)≥30%、类药性(durg-likeness，DL)≥0.18，基于数据库中的ADME参数对检索的活性成分筛选，并通过查阅相关文献进一步确定药物活性成分，最后获得活性成分的靶点蛋白.为了将蛋白名称进行标准化通过使用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)筛选物种人为加以标定.

1.2 PH相关靶点的筛选

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中检索关键词“pulmonary hypertension”，选取Relevance score高于10的靶点，得到PH相关的靶点.将PH相关靶点与葛根芩连汤相关靶点取交集并绘制韦恩图，提取出共同的靶基因.

1.3 构建药物-活性成分-靶点网络

将获得的葛根芩连汤中药物的活性成分靶点与PH靶点的交集信息整理成Excel表格，并导入到Cytoscape3.7.1软件中，调整节点的形状与颜色便于区别，得到药物-活性成分-靶点网络.

1.4 构建PPI网络

通过使用在线工具STRING(https://string-db.org/)构建PPI网络关系图，选择物种为Homo sapiens，并上传药物与疾病的共同靶基因，获得PPI网络中的关键节点基因.

1.5 共同靶点的富集分析

采用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对获得的共同靶点进行富集分析，筛选条件为物种为人同时阈值为P<0.05，进行GO(Gene Ontology)生物学过程富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析.

1.6 成分靶点分子对接

对筛选所得的葛根芩连汤中药物的核心活性成分与PH相关靶点进行分子对接验证.应用ChemOffice软件构建活性成分的3D结构来更直观的显示活性成分与靶点的相互作用关系图，使其能量最小化并保存为*mol2格式；选取PPI网络中度值排名前五的靶点蛋白，并从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中获得到靶点蛋白*PDB格式的3D结构；采用PyMOL软件对蛋白质进行处理，再通过Auto Dock软件使活性成分及靶蛋白转换为*pdbqt格式，并运行Vina软件完成对接，最后再次使用PyMOL软件将化合物与蛋白对接结果进行分析.

2 实验结果

2.1 葛根芩连汤中活性成分的筛选与整理

葛根、黄芩、黄连、甘草在TCMSP中检索得到489个化合物，其中葛根有18个，黄芩有143个，黄连有48个，甘草有280个.通过设置筛选条件为OB≥30%同时满足DL≥0.18，筛选得到146个活性成分，其中葛根4个，黄芩36个，黄连14个，甘草92个.查阅文献发现[3]，puerarin、daidzein、daidzin、genistein、sitogluside、scoparone也为其主要活性成分.统计发现方剂中四味药材所含的活性成分存在交集，见图1，葛根芩连汤中部分化合物基本信息见表1.

图1 葛根芩连汤中药材的活性成分关系图

表1 葛根芩连汤中部分化合物基本信息

2.2 药物-疾病共同靶点的筛选

借助TCMSP数据库收集到葛根芩连汤中146个化合物所对应的靶点共274个；使用GeneCards数据库选取评分高于10分的PH靶点974个；将葛根芩连汤和PH的靶点取交集后，得到112个共同靶点(图2)，可能为葛根芩连汤治疗PH的关键靶点.

图2 葛根芩连汤-肺动脉高压共同靶点韦恩图

2.3 葛根芩连汤-化合物-靶点相互作用网络

葛根芩连汤-化合物-靶点网络关系图如图3所示.

其中倒三角形节点表示为共同靶点，圆形节点表示活性化合物，正方形节点表示葛根芩连汤中的四味中药；每条边则表示两个节点间存在相互作用关系.根据网络中的拓扑学性质进行分析，对于一些连接关系较多的节点在整个网络中可能是关键的化合物或者靶点.从化合物的角度分析，作用靶点数大于10的化合物有28个，排名前五的化合物分别是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山奈酚、MOL000481-染料木黄酮、MOL000390-黄豆苷元、MOL000173-汉黄芩素.从靶点的角度分析，能与10个以上的化合物作用的靶点有13个，排名前五的靶点蛋白分别是PTGS2、ESR1、NOS2、PPARG、PTGS1.

图3 葛根芩连汤药材-化合物-靶点网络

2.4 PPI网络的构建

从STRING数据库中获取到共同靶点互作网络，见图4，该网络中包含112个节点(包含一个有利节点)和2 295条边，其中各靶点的相连节点数见图5，排名前五的靶点分别是INS、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK3.

图4 共同靶点PPI网络图

图5 PPI网络中靶点相邻节点数

2.5 共同靶点的富集分析

应用DAVID数据库进行的GO功能富集分析，结果显示共有160个条目(P<0.05)，其中包括115个生物学过程(BP)条目，21个细胞组成(CC)条目，24个分子功能(MF)条目，见图6.

图6 共同靶点的GO功能分析

KEGG分析结果显示有103条信号通路(P<0.05)，其中包括HIF-1信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、Toll样受体信号通路等，其中HIF-1信号通路涉及EGFR、IL6、ERBB2、STAT3、TIMP1、AKT1、MAPK1、CDKN1A、HIF1A等靶点.选取P值较小的20个通路进行可视化分析，具体结果见图7.

图7 共同靶点的KEGG富集分析:(A:KEGG-P值和基因数目；B：KEGG-基因)

2.6 葛根芩连汤中活性成分作用与核心靶点的分子对接结果

在“葛根芩连汤-化合物-靶点”网络分析中，根据拓扑学参数计算得出排名前10的核心化合物与PPI网络中前十的核心靶点进行分子对接，分子对接结果见图8，结果显示，配体与受体结合能量影响着结合构象的稳定性，其能量越低，稳定性越高，相互作用的可能性也随之变大.本实验中选取的葛根芩连汤化合物与PH共同靶点的结合能均为负值，皆在-6.72～-37.8 kJ·mol-1范围内，提示化合物与受体有一定的结合活性.由图9可直观的展现出部分活性化合物与受体分子对接模式，证明了葛根芩连汤的活性成分与PH相关的靶标蛋白具有较强的结合活性.

图8 葛根芩连汤对肺动脉高压作用靶点分子对接的结合能

图9 部分活性化合物与受体分子对接模式

3 讨 论

肺动脉高压的发病机制较为复杂，通常认为静息状态下平均肺动脉压≥3.325 Pa即为肺动脉高压.从中医角度来说肺动脉高压的病因主要是以宗气不足为本，痰瘀阻滞为标[4].因此，临床治病应以补益宗气、活血化瘀为主.葛根芩连汤作为中医药中的经典方剂，主成分也很常见包括葛根、黄芩、黄连、甘草.这四味药的主要化学成分研究也比较多，例如葛根中的葛根素、黄连中的小檗碱、黄芩中的汉黄芩素、甘草中的甘草醇等.有研究表明[5]葛根素对缺氧性肺动脉高压具有一定作用，黄连中的小檗碱对肺小动脉收缩也有一定抑制作用[6].目前葛根芩连汤在临床上应用广泛，在多种疾病中都具有一定疗效，包括对心血管疾病的治疗.

本次研究通过网络药理学的方法，对葛根芩连汤治疗肺动脉高压的可能作用机制进行了预测，共得到146个主要活性成分，112个共同作用靶点，160条生物过程和103条信号通路.其中，葛根芩连汤的主要活性成分可能是槲皮素、百蕊草素Ⅲ、金雀异黄素、黄豆苷元、汉黄芩素、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花黄素、葛根素、异黄酮等.另有研究表明，槲皮素可以通过改善肺血管重构达到降压的效果[7].此外，柚皮素通过显著增加l -精氨酸达到肺动脉高压的改善作用[8].金雀异黄素可能通过PI3K/Akt-eNOS来改善肺动脉高压[9].葛根素可能通过抑制自噬阻止低氧诱导的肺动脉高压的进展[10].通过网络药理学技术，从葛根芩连汤中筛选出了对治疗肺动脉高压的重要靶点，主要有INS、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK3、PTGS2、EGF、JUN、MAPK8等作用靶点.IL6作为重要的炎症因子，在肺动脉高压中具有高表达性[11]，可进一步引起肺血管内皮的损伤，增加血管的阻力，加重病情.VEGFA是血管内皮生长因子，对血管内皮功能具有非常重要的影响，在肺动脉高压中也有着一定的作用[12].JUN作为重要的调节因子参与细胞的多种活动，对细胞的多种生命活动过程都具有影响[13].通过KEGG通路富集分析筛选得到103条信号通路，涉及到的HIF-1信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等通路.HIF-1作为缺氧诱导因子，近几年研究发现，其对肺动脉高压具有一定影响，尤其对缺氧性肺动脉高压影响显著.MAPK1参与生长因子的信号传递，对细胞的增殖、迁移、侵袭等多种生命活动具有重要的意义[14].TNF信号通路可以通过促进IL6表达，加重血管内皮的损伤，影响细胞的增殖和调控，使血管阻力增加，加快了肺动脉高压的发展进程[15].因此，葛根芩连汤可能通过对细胞增殖及炎症等多方面的影响，来改善肺动脉高压的发展过程.

利用AutoDock Vina软件对筛选得到的排名靠前的活性成分及靶点蛋白进行分子对接，提示筛选出的潜在靶点和活性成分结合性较高，验证了运用网络药理学方法对葛根芩连汤治疗肺动脉高压的机制进行了初步探讨的可靠性.

综上所述，葛根芩连汤对肺动脉高压病具有多靶点、多通路的治疗优势，但信号通路及靶点之间的联系还需要具体实验的进一步探讨，以便于更好的应用到临床等相关研究中.