局部进展期中低位直肠癌新辅助放化疗疗效预测分子标志物的研究进展

袁野，田少博，张培，陶凯雄，王国斌 ，王征,3

1.华中科技大学同济医学院附属协和医院胃肠外科，湖北 武汉430022；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院组织工程与再生医学研究中心，湖北 武汉430022；3.湖北省微创外科医学临床研究中心，湖北 武汉430022

目前控制和改善局部进展期中低位直肠癌(locally advanced mid-low rectal cancer, LARC)病情和预后的重要方式是多模式治疗，主要包括术前新辅助放化疗、直肠全系膜切除术、术后辅助化疗等。其中新辅助放化疗(neoadjuvant chemoradiotherapy, nCRT)作为LARC治疗策略的重要环节，在降低局部复发率、增加保肛率、提高肿瘤切除率及延长无病生存期等方面具有明显优势[1]。但nCRT同时会带来严重不良反应，包括大便排空障碍、大便失禁等放射相关大肠功能障碍以及性功能障碍等[2]。

由于个体差异，LARC病人对nCRT反应不一致。病理完全缓解(pathologic complete response, pCR)作为反应良好的评价指标之一，其概率为4%～24%[3-5]，这部分病人预后较好。Chang等[6]回顾性分析749例接受nCRT的LARC病人，pCR病人预后明显优于无降期病人(>ypT1～2N0)， 5年总生存率分别为92.7%和80.4%(P=0.001)，5年无病生存率分别为93.5%和65.7%(P<0.000 1)，5年复发率分别为1.8%和8.8%(P=0.004 8)。对nCRT反应差的病人无法从治疗中获益；相反，长时间nCRT治疗增加疾病进展风险，带来严重毒副反应。

提前通过分子标志物判断LARC病人对nCRT的反应性，有助于对拟行nCRT病人进行分层治疗。对nCRT预测反应好的LARC病人可选择先nCRT治疗，后续衔接保肛手术；对nCRT预测反应差的可改行强化放化疗，或直接行手术治疗。新辅助分层治疗对改善病人预后，减轻不良反应及减少经济负担等具有积极意义。

本文对截止于2020年5月PubMed上发表文章进行检索，检索关键词包括：rectal、chemoradiotherapy(主题词)、preoperative、chemoradiation、neoadjuvant、chemotherapy、chemoradiosensitivity、chemoradioresistance、predictor、predict、risk factors、predicting、prediction、predictive、prognosis、prognostic、indicator、poor outcome、response。通过阅读标题及摘要，筛选出324篇预测LARC病人nCRT疗效文献。其中225篇文献因以下条件被排除：(1)临床数据，(2)影像学数据，(3)miRNA，(4)高通量基因测序数据，(5)文献综述及Meta分析。最终筛选99篇文献，其中36篇代表性文献纳入本文进行综述，文献检索流程见图1。

图1 文献检索流程图

一、LARC新辅助分层治疗现状

欧洲肿瘤内科学会(ESMO)指南对nCRT在LARC病人中应用进行详细分层，根据肿瘤位置、T分期、N分期、直肠系膜筋膜(mesorectal fascia, MRF)状态、侧方淋巴结等指标将LARC病人分为低危、中危、高危三组。对低危组病人推荐直接手术治疗，中危组病人推荐行短程放疗，高危组病人则推荐长程放化疗。

相比于美国国立综合癌症网络(NCCN)指南，ESMO指南减少了放疗在nCRT中的比重，可降低放疗相关并发症的发生率。但ESMO指南主要基于CT、MRI、内镜等资料对LARC病人进行分层，具有一定局限性：影像学评估淋巴结是否受侵犯准确率不高，仅凭淋巴结增大无法判别恶性淋巴结[7-8]。因此寻找新的分子标志物指导nCRT分层治疗是必要的。

二、新辅助治疗疗效预测的分子标志物

1.胸苷酸合成酶相关分子标志物 胸苷酸合成酶(TS)由TYMS基因编码，具有催化dUMP形成dTMP作用，在DNA合成中至关重要[9]。TYMS基因5′UTR启动子区包含2个或3个28 bp的串联重复序列(2R或3R)。TYMS基因中重复序列越多(3R)，TS表达量及活性越高[10]。

氟尿嘧啶(5-FU)类药物可靶向TS，起放疗增敏作用。目前发现肿瘤组织中TYMS基因型3R/3R病人TS蛋白过表达，对5-FU类药物的nCRT治疗方案反应较差[11-12]。然而，近年来也有研究得出不同结论，Nelson[13]及Lamas[14]等研究发现只要具有一个TYMS3G(3R等位基因的一种)等位基因病人，对5-FU的nCRT治疗方案反应较好，可能原因是此类病人肿瘤组织中TS蛋白过表达导致5-FU作用位点增多，提高放疗敏感性。TYMS基因型作为nCRT疗效分子标志物，对指导新辅助分层治疗具有一定应用前景，但仍需深入研究加以验证。

与TYMS基因型类似，肿瘤组织中TS蛋白作为预测nCRT疗效分子标志物同样存在争议。Negri等[15]研究发现TS蛋白高表达病人nCRT治疗后具有更高pCR率。Kikuchi等[16]利用包括TS蛋白在内的多种蛋白构建预测模型，能有效预测LARC病人对nCRT治疗反应。然而，部分研究发现TS蛋白表达水平与nCRT疗效并无显著相关性[17]。

Tan等[18]将分子标志物应用于临床治疗，根据TYMS基因型将拟行nCRT的T3/T4， N0～2，M0～1直肠癌病人分为低风险组(2R/2R、2R/3R、2R/4R)和高风险组(3R/3R、3R/4R)，前者给予标准nCRT方案治疗，后者在标准nCRT方案基础上增加伊立替康，结果显示均取得较好治疗效果：低风险组降期率及ypT0率分别为64.4%和20%，高风险组降期率及ypT0率分别为64.5%和42%。

2.表皮生长因子受体信号通路相关分子标志物 表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)蛋白具有酪氨酸激酶活性，在结直肠癌中高表达。EGFR激活下游基因表达，促进细胞增殖，抑制凋亡[19]。EGFR信号通路则可诱导同源重组(homology-directed repair, HDR)DNA修复和非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)DNA修复[20-21]，抵抗放疗所诱导的肿瘤细胞DNA损伤。这可解释肿瘤组织高表达EGFR的LARC病人对nCRT反应差[22-23]。

RAS是EGFR下游MAPK级联信号通路重要分子。KRAS突变在结直肠癌发生过程中较为常见[24]。KRAS突变能否预测nCRT反应尚存在争议。部分研究结果显示KRAS突变的LARC病人对nCRT反应差[25-26]。然而，另有研究证实KRAS突变与LARC病人对nCRT反应不相关[27]。

PI3K/PTEN/AKT/mTOR是EGFR下游重要通路，通过多种途径介导肿瘤细胞对放化疗抵抗，包括促进DNA损伤修复、促进细胞增殖、抑制凋亡以及参与低氧相关信号通路等[28]。研究显示PI3K催化亚基PIK3CB在对nCRT抵抗的病人肿瘤组织中表达量较高[29]，PTENrs12569998多态性与nCRT治疗后TRG分级相关[30]。Koyama等[31]研究发现AKT活性与病人对nCRT反应性相关，体外实验进一步证实AKT抑制剂能增强肿瘤细胞对nCRT的反应性。Abdul-Jalil等[32]对33个PI3K及MAPK通路相关基因进行测序分析，结果发现PI3K通路相关基因突变与较低pCR率相关。

3.血管生成相关分子标志物 血管内皮生长因子(VEGF)是促进肿瘤血管生成的重要因子，与肿瘤发生和转移密切相关[33]。Edden等[34]研究发现，过表达VEGF肿瘤治疗反应差。Zlobec等[35]得出相似结论，发现对nCRT无反应LARC病人的肿瘤组织中VEGF表达量明显高于有反应的肿瘤组织。然而Hur等[17]得出了相反的结论，其研究发现高表达VEGF的LARC病人经nCRT治疗后出现pCR概率更高。

4.凋亡相关分子标志物 诱导细胞凋亡是化疗或放疗杀伤肿瘤的关键机制。Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族成员，抑制细胞凋亡，使肿瘤细胞对放化疗产生耐受。Grdina等[36]研究发现， Survivin蛋白表达下调后，人结直肠癌细胞系RKO36放疗敏感性增强。Rödel等[37]对59例nCRT治疗后LARC病人的肿瘤标本进行分析，发现高表达Survivin蛋白病人nCRT治疗后肿瘤细胞凋亡更少。Takasu等[38]研究结果显示，肿瘤组织内的Survivin表达与pCR率呈负相关，提示Survivin蛋白表达可能作为nCRT疗效的重要预测因子。

放疗是抗击癌症的有效手段。p53则是参与放疗作用的关键分子之一[39]。p53表达能够诱导细胞周期停滞、DNA损伤修复及诱导凋亡等。部分研究发现肿瘤组织高表达p53的LARC病人多呈放疗抵抗，p53蛋白过表达可作为LARC病人对nCRT抵抗的分子标志物[40-41]。另有部分研究发现p53蛋白表达水平与LARC病人对nCRT反应无关[42-43]。基于p53对nCRT是否有预测价值的不同结论，Chen等[44]对30项研究中1 830例病例进行了荟萃分析，结果显示野生型p53状态(p53蛋白低表达和/或野生型p53基因)与nCRT治疗后病理反应相关，且p53基因型比p53蛋白表达更具有预测价值。Kandioler等[45]研究也得到类似结论。(表1)

5.DNA损伤修复相关分子标志物 放疗通过诱导DNA双链断裂杀伤肿瘤细胞，而DNA损伤修复是导致肿瘤细胞对放疗产生抗性的重要机制。HDR和NHEJ是真核细胞中促进损伤DNA损伤修复的主要途径。HDR依赖同源序列，精确修复DNA损伤；而NHEJ不依赖于同源序列，修复速度快，但错误率高。研究显示，XRCC3、ERCC1、RFC4、Ku70、Ku80等分子通过HDR或NHEJ方式参与DNA损伤修复过程，这些分子与LARC病人对nCRT反应有关[46-49]。

三、生物组学研究

因肿瘤异质性的存在，单一分子标志物预测nCRT疗效价值较低，不同研究常得出互相矛盾的结论。随着高通量研究技术的出现，生物组学逐渐兴起。生物组学是对整个生物分子群组的研究，有望在肿瘤预防、诊断及治疗等方面发挥巨大作用。

表1 新辅助治疗疗效预测的分子标志物总结

基因测序技术使同时研究大量基因表达成为可能。Ghadimi等[50]将23例行nCRT的LARC病人分为反应组及无反应组，利用基因芯片技术对治疗前肿瘤组织进行测序分析，确定了54个差异表达基因，这些差异表达基因预测nCRT疗效的敏感性及特异性分别为78%和86%。Watanabe等[51]从52例行nCRT直肠癌病人中鉴定出33个差异表达基因，在另一队列17例病人中预测nCRT疗效准确率达到82.4%。

近年来，通过蛋白质组技术预测nCRT反应分子标志物越来越多。Croner等[52]根据LARC病人对nCRT治疗反应从肿瘤组织中鉴定出数百个差异调节的蛋白质。Smith等[53]认为肿瘤组织蛋白表达是一个动态的过程，在开始治疗的24 h/48 h内血清中14种差异表达蛋白质共同区分了病人对nCRT治疗的反应性，敏感性和特异性分别达到87.5%和80%。

代谢组学可同时对大量代谢物进行整体和定量分析，成功应用于癌症早期诊断、治疗反应预测等。Jia等[54]基于非靶向代谢组学技术分析血清样本得到15种不同表达的代谢物，这些代谢物可用于鉴定LARC病人中潜在对nCRT的敏感者。

四、结语

目前为止，预测LACR病人nCRT治疗疗效的分子标志物临床信息有限，尚无广泛认可的分子标志物，部分分子标志物在不同研究中甚至得出不同结论。应用生物组学技术可同时研究大量基因或蛋白质等分子标志物，预测准确性较高，但不同研究间各种潜在预测标志物几乎没有重叠，同样未应用于临床。笔者认为目前对nCRT分子标志物研究的主要局限性在于：(1)各个研究样本量小、nCRT方案不尽相同、研究技术方案不一致等；(2)肿瘤组织存在异质性，仅对一个区域进行采样无法代表整个肿瘤组织生物学特征；(3)多种证据表明肿瘤组织对细胞毒性疗法的反应是动态过程，随着治疗进展，多种基因表达改变产生对nCRT治疗耐受[55]；(4)活检肿瘤组织标本包含一定量正常组织，正常组织含量不同可能会对测序结果产生影响[56]。

分子标志物对指导LARC病人分层治疗以及开发靶向药物等具有积极意义。随着精准医疗发展，具有高度敏感性及特异度分子标志物会被鉴定出来，为个体化治疗提供指导。