原发性肝癌病人血清hsa_circRNA_103809的表达及临床意义

张荣，陈婧，黄江涛，吕海龙，杨一邨，王浩斌，张抒

1.成都市第三人民医院普外科，四川 成都 610031；2.都江堰市人民医院消化内科，四川 成都 611830

原发性肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，由于其发病率和死亡率不断升高，已经成为全球重大公共健康卫生难题之一[1]。全球癌症最新数据显示，在所有恶性肿瘤中，原发性肝癌发病率排名第5位，死亡率排名第2位[2]。我国是原发性肝癌的高发区，在我国所有恶性肿瘤中，原发性肝癌发病率排名第4位，死亡率排名第3位[3]。由于肝脏解剖结构特殊，原发性肝癌易转移和复发，且常伴有门静脉癌栓，恶性程度高，预后非常差[4]。因此，探索原发性肝癌发生发展的分子机制，寻找准确可靠的早期诊断和预后评估的生物学标志物，可以实现原发性肝癌的早期诊断、提早治疗和干预，有助于提高病人生存质量、改善病人的预后。环状RNA(circRNA)是一种环状的内源性非编码RNA，高度保守，广泛表达在人类细胞中[5]。近年来，有大量文献报道circRNA在恶性肿瘤的发生发展中扮演重要角色[6-8]。最近，有文献报道抑制hsa_circRNA_103809的表达可以抑制肝癌细胞的增殖、阻滞细胞周期、抑制细胞迁移[9]，但临床尚缺乏hsa_circRNA_103809与原发性肝癌关系的研究报道。因此，本研究对原发性肝癌病人和健康体检者血清中的hsa_circRNA_103809进行了检测，探讨hsa_circRNA_103809在原发性肝癌早期诊断和疗效预后评估中的临床价值。

资料与方法

一、临床资料

选取2016年6月至2019年6月成都市第三人民医院收治的83例经病理确诊的原发性肝癌病人设置为肝癌组，男性44例，女性39例，年龄(61.27±15.43)岁。病人具体病理特征资料见表1。纳入标准：病理确诊病人；临床资料完整；病人知情同意，并签署知情同意书。排除标准：术前采取放化疗；合并其他肿瘤；不能耐受手术或围手术期死亡。选取同时期我院健康体检者75例设置为健康对照组，男性38例，女性37例，年龄(61.16±14.26)岁。在肝癌组后续治疗的随访中，有11例失访。接受治疗且获得完整临床资料的72例随访对象中，男性38例，女性34例，年龄(60.33±14.45)岁。其中有51例存活病人设置为存活组，21例死亡病人设置为死亡组。

所有纳入对象无糖尿病、高血压、慢性阻塞性肺疾病史，无自身免疫性疾病史及免疫抑制药用药史，无肝炎、艾滋病等感染病史，排除孕妇和哺乳期妇女。本研究经我院伦理委员会批准，所有纳入对象知情并签署知情同意书。

二、方法

1.标本采集 取病人入院后或手术2周后清晨空腹肘静脉血，在4 ℃冰箱中静置30 min后低速离心(1 500 r/min)20 min，取上清，放入-80 ℃冰箱中保存待用。

2.实时荧光定量PCR 取出冻存血清，运用碧云天生物技术有限公司的RNA提取试剂盒，按照说明书用硅胶膜离心柱提取总RNA。提取出的总RNA用DEPC处理过的无RNA酶水溶解。运用日本Takara公司的逆转录试剂，按照说明书，将RNA逆转录为cDNA。运用日本Takara公司SYBR试剂进行实时荧光定量PCR检测，按照说明书，反应体系总体积20 μL，包括水，1 μL cDNA，SYBR Green I master-mix，0.5 μmol/L的前向和反向引物；反应条件为预变性95 ℃ 5 min，40个循环(95 ℃ 15 s，60 ℃，1 min，72 ℃ 30 s)。检测仪器为Biorad qPCR CFX 96，设置3个复孔，取平均值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，计算2-ΔΔCt来检测hsa_circRNA_103809表达水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，序列如下：hsa_circRNA_103809上游引物：5′-ACGCATTCTTCGAGACCTCT-3′,下游引物：5′-TGCCTGTAACTCCTCTTCAGT-3′；内参GADPH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

三、统计学分析

采用SPSS(19.0版)统计软件进行数据分析，数据采用中位数(四分位间距)[M(P25，P75)]表示。正态分布检验采用Kolmogorov-Smirnov检验(K-S检验)，两组数据间比较用Mann-WhitneyU检验，治疗前后比较用配对t检验。用GraphPad Prism6软件绘制受试者工作特征(ROC)曲线，并统计曲线下面积(AUC)来检验hsa_circRNA_103809效能。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

检测结果显示，hsa_circRNA_103809在肝癌组血清中相对表达量为2.51(1.14，3.87)，在健康对照组血清中相对表达量为1.14(0.54，1.35)。对比发现，肝癌组hsa_circRNA_103809表达水平较健康对照组高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 各组血清中hsa_circRNA_103809相对表达水平散点图

原发性肝癌病人血清hsa_circRNA_103809表达水平与病人的性别、年龄、甲胎蛋白(AFP)表达量、丙氨酸转氨酶(ALT)表达量和HBV是否阳性无明显相关性(P>0.05)，而与肿瘤直径、有无门静脉癌栓、淋巴结转移、脏器转移和TNM分期具有明显相关性 (P<0.05)。进一步分析提示，原发性肝癌病人肿瘤越大、发生淋巴结转移、有脏器转移、有门静脉癌栓和TNM分期越高，血清hsa_circRNA_103809表达水平越高，见表1。

接受手术治疗的原发性肝癌病人术前hsa_circRNA_103809相对表达量为2.56(1.82，3.65)，术后相对表达量为1.72(1.38，3.11)，原发性肝癌病人手术后hsa_circRNA_103809的表达水平较手术前显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。手术后随访12个月，分析显示原发性肝癌存活组血清hsa_circRNA_103809的相对表达量为2.13(1.05，3.02)，明显低于死亡组血清hsa_circRNA_103809的相对表达量3.21(2.75，3.35)，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

表1 hsa_circRNA_103809表达水平与原发性肝癌病人临床病理特征的关系

图2 原发性肝癌病人手术前后hsa_circRNA_103809相对表达水平散点图

ROC曲线分析显示血清hsa_circRNA_103809表达水平对原发性肝癌的诊断效能好，曲线下面积为0.891，诊断临界值为2.79，特异度达81.93%，敏感度达85.33%。(图4)

图3 原发性肝癌术后存活组和死亡组血清中hsa_circRNA_103809相对表达水平散点图

图4 原发性肝癌组血清中hsa_circRNA_103809区别于健康组的诊断效能

讨 论

对于疾病研究，生物学标志物一般是指可供客观测定和评价的生理或病理特征性的生化指标，要求具有稳定性和重复性好，特异度和灵敏度高。circRNA是新近发现的一种共价闭合环状结构的非编码RNA，具有高度保守性和特异性表达的特点，可调控基因表达或结合RNA相关蛋白发挥生物学功能[10-11]。研究显示circRNA不受反复冻融、RNA酶降解的影响，生物学稳定[12-13]，可作为疾病早期诊断、治疗和评估预后的生物学标志物。

近几年来，有越来越多的文献研究报道，部分circRNA可作为肿瘤早期筛查和预后评价的标志物[14-16]。Yin等[17]通过对比乳腺癌和健康体检者的circRNA测序数据分析确定22个circRNA表达下调，19个circRNA表达上调，并且他们通过绘制乳腺癌表达图谱推测hsa_circRNA_0001785可能是乳腺癌的生物学标志物。Chen等[18]通过对前列腺癌组织和癌旁组织进行测序，结果显示有7 232个circRNA与前列腺癌有关。他们进一步验证发现circCSNK1G3可通过与miRNA181结合促进癌细胞生长增殖，有望作为前列腺癌早期筛查的标志物。最近，有基础实验证实hsa_circRNA_103809可以促进原发性肝癌的发生和进展[9]，但目前临床对hsa_circRNA_103809与原发性肝癌关系的研究报道较少。因此，本研究纳入了83例病理确诊的原发性肝癌病人和75例健康体检者，检测了这些对象血清中hsa_circRNA_103809的表达，探究其在原发性肝癌诊断、治疗和预后中的临床意义。结果提示原发性肝癌病人血清中hsa_circRNA_103809的表达水平显著高于健康组，且hsa_circRNA_103809的表达水平与肿瘤直径、有无门静脉癌栓、淋巴结转移、脏器转移和TNM分期具有明显相关性。同时，我们发现原发性肝癌病人手术后较手术前血清中hsa_circRNA_103809的表达水平前显著降低。对这些接受手术的原发性肝癌病人随访1年后，我们还发现原发性肝癌存活组血清hsa_circRNA_103809的表达水平明显低于死亡组。这些结果提示hsa_circRNA_103809可能是原发性肝癌早期诊断治疗和预后评估的标志物。进一步的ROC曲线显示血清hsa_circRNA_103809表达水平对原发性肝癌诊断的诊断效能好，特异度和敏感度较高。但值得注意的是，由于本研究纳入对象较少且存在部分失访病人，在后续研究中需增加样本量进一步验证该结论。

尽管本研究结果表明hsa_circRNA_103809表达水平高低与原发性肝癌的发生发展及预后有关，但是具体分子机制尚未阐明。近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。Huang等[19]在胃癌研究中发现，hsa_circRNA_103809可以通过结合miRNA-101-3p促进胃癌细胞的侵袭和迁移。Bian等[20]在结直肠癌研究中发现，hsa_circRNA_103809可以通过miRNA-532-3p/FOXO4轴调节癌细胞的增殖和迁移。因此，在接下来的研究中需要明确hsa_circRNA_103809在原发性肝癌发生发展中的具体分子机制，为hsa_circRNA_103809的临床应用提供理论基础。

总之，以上结果提示hsa_circRNA_103809在原发性肝癌病人血清中高表达，且其表达水平高低与原发性肝癌的发生发展及预后有关。随着研究深入，hsa_circRNA_103809有望成为诊断原发性肝癌及评估预后的生物学标志物。