肿瘤标志物和Ki67在结直肠癌中的表达及预后因素分析

黎华丽，郑勇斌，程煌荣，杨超

武汉大学人民医院胃肠外科，湖北 武汉 430064

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤之一[1]。据我国恶性肿瘤统计结果显示，CRC发病率居于第3位，病死率居第5位，且发病率仍处于上升趋势[2-3]。而临床上多数CRC病人在确诊时即处于进展期，CRC的防治工作仍任重道远。美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)制定的TNM分期是目前应用最广泛的CRC分期系统之一，对预后评估及后续治疗指导有重要意义，但在临床实践中，相同分期病人的预后也可能存在差异[4]。因此还需要联合其他指标一同评估预后，以制定合适的治疗方案。其中，癌胚抗原(CEA)是唯一被推荐用于CRC常规监测的血液学指标，被认为是针对CRC早期诊断、病情发展以及预后的一个较好的肿瘤标志物[5-6]。而癌抗原19-9(CA19-9)存在于胃肠道黏膜、胰腺、胆囊等正常组织细胞表面，在CRC、胃癌等恶性肿瘤中表达水平显著升高，可作为辅助诊断指标，但缺乏特异性[7]。二者的联合检测被广泛用于CRC的诊断及预后评估。CRC术后病理指标如Ki67表达指数(lable index,LI)也表现出一定的预后价值，其作为增殖标志物，广泛用于肿瘤分级[8]。Ki67已被证实与人CRC的发生发展密切相关，被认为是CRC的一个重要预测参数[9]。有研究指出CRC中Ki67高表达与较差的预后相关，但据目前研究，Ki67 LI并不总是与病人预后相关[10-11]。目前国内少有联合术前血清肿瘤标志物与术后Ki67分析CRC病人预后的研究，因此本研究将Ki67的预后影响与CEA、CA19-9进行单独或联合比较，进行回顾性研究，以分析血清CEA、CA19-9表达和肿瘤细胞Ki67 LI的联合检测对CRC病人预后评估的价值。

资料与方法

一、一般资料

选取2012年1月至2014年6月在武汉大学人民医院胃肠外科就诊的311例CRC病人为研究对象，进行回顾性分析。本研究经武汉大学人民医院伦理委员会批准。病例按照美国癌症联合委员会(AJCC)制定的TNM分期标准进行临床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期149例，Ⅲ～Ⅳ期162例。

二、纳入及排除标准

纳入标准：(1)经组织病理确诊为腺癌的CRC病人；(2)至少经手术切除原发病灶；(3)具有完整的病历资料；(4)术前未经放化疗及其他方式治疗。排除标准：(1)术前合并急慢性感染者；(2)合并肠穿孔或肠梗阻；(3)其他原发恶性肿瘤。

三、方法

收集病人病案资料，包括年龄、性别、联系方式、肿瘤分化程度、肿瘤部位、远处转移、TNM分期、肿瘤最大直径、神经侵犯、脉管癌栓、外周血CEA、CA19-9及Ki67 LI等信息。以电话和门诊随访为基础，术后第1年随访间隔为每3个月1次，之后每隔6个月随访1次。术后随访截止时间为2019年6月1日。

四、观察指标检测及相关定义

采集病人入院空腹静脉血3～5 mL，CEA采用直接化学发光法进行检测，由检验科完成，正常值范围为0～5 μg/L；CA19-9采用ARCHITECT CA19-9XR试剂进行检测，由检验科完成，正常值范围为0～35 kU/L。采用免疫组织化学法检测肿瘤细胞Ki67表达，即用型鼠抗人单克隆抗体Ki67购自罗氏公司。结果判断：Ki67定位于细胞核，呈棕黄色颗粒为阳性细胞；按阳性细胞比例分为：≤10%(-),11%～25%(+),26%～50%(++),≥50%(+++)。如图1。CEA>5 μg/L定义为阳性，CA19-9>35 kU/L定义为阳性。Ki67 LI大于其对应截断值定义为高表达(阳性)。肿瘤标志物与Ki67并联检测时，全阳性定义为阳性，其余定义为阴性。

五、统计学分析

采用SPSS(25.0版)软件统计分析。绘制受试者工作特征(ROC)曲线寻找Ki67 LI的截断值[曲线下面积(AUC)最大时]；组间单因素分析采用Log-Rank法检验；Cox回归分析寻找影响CRC病人预后的独立危险因素，得出独立危险因素的风险比(HR)。所有分析均采用双侧检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

图1 结直肠癌病理组织免疫组化Ki67表达(苏木素染色，×200) A.Ki67 LI 95%; B.Ki67 LI 10%

结 果

一、一般情况

按照入组标准，共收集311例病人临床病理资料，其中男性174例，女性137例，中位年龄63岁(26～89岁)。中位随访时间为70个月(3～89个月)，其中失访18例，随访率94.2%(293/311)，随访期间病人发生肿瘤转移或拒绝信息采集6例；死亡101例，病死率32.5%(101/311)。详见表1。Ki67 LI的截断值、灵敏度、特异度、AUC分别为0.34、0.528、0.816、0.727，见图2。

二、单因素生存分析结果

生存分析结果显示，CEA阳性、CA19-9阳性和Ki67高表达与CRC病人总生存人数及5年生存率相关(均P<0.01)。此外还与病理类型为低分化、有脉管癌栓、神经侵犯、有淋巴结转移以及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期有关(均P<0.01)。详见表1、表2。联合血清肿瘤标志物和Ki67 LI时，Log-Rank检验结果显示，均阴性时病人预后最好，单阳性时次之，均阳性时最差，5年生存率的差异有统计学意义(均P<0.01)。详见表2。

三、Cox回归分析

Cox回归多因素分析显示，CRC TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、CEA阳性、CA19-9阳性、CEA+Ki67阳性及CA19-9+Ki67阳性是CRC病人预后的独立危险因素(均P<0.05)。当校正其他影响因素后，CEA阳性的CRC病人的死亡风险是CEA阴性病人的6.461倍[95%CI(3.693，11.304)，P<0.01]；CA19-9为2.046倍[95%CI(1.214,3.449)，P=0.007]；TNM分期Ⅲ～Ⅳ的病人死亡风险是TNM分期Ⅰ～Ⅱ病人的2.104倍[95%CI(1.597,5.242)，P=0.028]；CEA+Ki67阳性病人的死亡风险为CEA+Ki67阴性病人的9.992倍[95%CI(5.337,18.706)，P<0.01]；CA19-9+Ki67为5.345倍[95%CI(2.282,12.521)，P<0.01]。CEA+CA19-9、CEA+CA19-9+Ki67联合检测并未进入回归模型。详见表3。

表1 311例结直肠癌病人预后单因素分析

图2 Ki67 LI受试者工作特征(ROC)曲线

表2 311例结直肠癌病人并联检测指标结果与预后单因素分析

表3 本组结直肠癌病人预后的Cox回归多因素分析结果

讨 论

肿瘤分子标志物是恶性肿瘤在生长及增殖过程中产生的一类特异性物质，如术前CEA、CA19-9是目前临床上CRC病人最常检测的指标。Ki67 LI也是术后肿瘤组织病理免疫组化中的检测项目之一。本文首次将肿瘤标志物与术后病理指标联合起来检测，探讨了CEA+Ki67、CA19-9+Ki67及CEA+CA19-9+Ki67在评估CRC病人预后方面的价值。Log-Rank检验结果提示，联合肿瘤标志物和Ki67 LI均阴性时病人预后最好，单阳性时次之，均阳性时最差；进一步行多因素Cox回归分析显示，CEA+Ki67阳性、CA19-9+Ki67阳性、CEA阳性、CA19-9阳性以及TNM分期Ⅲ～Ⅳ均为CRC病人预后的独立危险因素。当校正其他影响因素后，CEA阳性CRC病人的死亡风险是CEA阴性病人的6.461倍[95%CI(3.693,11.304)，P<0.01)；CA19-9为2.046倍[95%CI(1.214,3.449)，P=0.007]；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人死亡风险是TNM分期Ⅰ～Ⅱ期病人的2.104倍[95%CI(1.597,5.242)，P=0.028]；CEA+Ki67阳性病人的死亡风险为CEA+Ki67阴性病人的9.992倍[95%CI(5.337,18.706)，P<0.01]；CA19-9+Ki67为5.345倍[95%CI(2.282,12.521)，P<0.01]。CEA+CA19-9、CEA+CA19-9+Ki67联合检测未进入回归模型。这提示，联合联测肿瘤标志物和Ki67 LI对CRC病人的预后评估具有重要意义，对Ki67高表达、CEA或CA19-9阳性病人，即使临床分期较早，也应密切随访或采取更积极的治疗。

CEA和CA19-9是目前CRC中最常见的肿瘤标志物检测组合，两者联合检测对CRC的诊断、治疗和监测具有确切指导意义。CEA在多种腺癌细胞中有表达，尤其在CRC细胞中较常出现高表达，且血清CEA水平升高常与预后不良相关[12]；CA19-9是目前胰腺肿瘤常用监测标志物，其与CRC间关系也较为密切。有研究显示，CA19-9对转移性CRC也可提供有价值的预后信息，血清CA19-9水平升高与不良预后相关[12]。王宏等[13]报道，与良性病变组和对照组相比，血清CEA和CA19-9表达水平在CRC病人中显著升高，且CEA和CA19-9区分CRC与良性病变组、对照组的敏感性/特异性分别为63.1%/79.4%、66.2%/61.7%。作为较为简便、经济的检测指标，CEA和CA19-9已广泛用于CRC病人的诊断和随访，但其作为CRC诊断和预后的传统指标，尚存在敏感性不足、特异性较低等问题。本研究中，CEA+CA19-9联合检测时发现均阴性时预后最好，5年生存率为88.5%，单阳性时次之，双阳性时最差，5年生存率为10%。但多因素分析结果显示CEA+CA19-9阳性[HR=1.149,95%CI(0.750,1.759)，P=0.523]、CEA+CA19-9+Ki67阳性[HR=1.010,95%CI(0.678,1.505)，P=0.961]并非CRC不良预后的独立危险因素，而CEA+Ki67、CA19-9+Ki67联合阳性为独立预后因素。提示联合肿瘤标志物和Ki67 LI可能为CRC病人预后评估带来更好的效果。

Ki67蛋白是一种与细胞增殖特异相关的细胞核抗原，在增殖细胞的所有细胞周期活动期表达，在静止细胞中不表达，但Ki67蛋白的量随细胞周期的不同而发生改变[14]。大量研究证实，Ki67蛋白的高表达与肿瘤的生物学特性及肿瘤预后密切相关，Ki67因而成为检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一，目前已成为临床病理诊断常规检测项目，用于指导术后治疗方案的选择及预后评估[15]。据报道，在CRC中，Ki67高表达与分期晚、预后差相关，高表达组病人无病生存率显著低于低表达组病人。但也有回顾性研究显示Ki67表达高低与CRC病人临床结局间无直接联系，Ki67 LI并不总与CRC病人临床结局相关[11,16]。本研究中，Ki67表达与CRC病人术后总生存率和5年生存率相关。将Ki67分别与CEA、CA19-9两两联合或联合检测时发现，均阴性时预后最好，5年生存率分别为94.1%、94.1%、88.2%，单阳性时次之，双阳性时最差，5年生存率分别为14.3%、18.7%、8.5%。多因素分析结果显示Ki67+CEA、Ki67+CA19-9均为CRC病人的独立预后因素，而CEA+CA19-9、CEA+CA19-9+Ki67并非CRC病人不良预后的独立危险因素。提示并非简单联合肿瘤标志物和Ki67 LI即可增加预后判断的有效性，而是Ki67+CEA、Ki67+CA19-9联合检测可为CRC病人预后评估提供指导意义。此外，也有研究显示表皮生长因子受体(EGFR)的表达与CRC肿瘤转移和较短的病人生存时间相关，其他诸如K-ras和BRAF等免疫指标也可指导CRC病人预后[17-19]，联合这类免疫指标和肿瘤标志物或许也可得出类似结论，甚至更好地指导病人预后。需注意的是，本研究结果可能是本研究样本量较小引起的，此结论尚需更大样本量的临床试验验证。

本研究的结果提示，术前肿瘤标志物与术后病理指标Ki67的联合可能为CRC病人预后评估提供指导意义。但是，由于本研究是单中心的回顾性研究，选择偏倚可能较大，且目前国际上对于Ki67蛋白表达指数高低尚无明确的判定标准，该结论尚需更高质量的大样本临床研究验证。