miR-1306-5p 靶向水通道蛋白1对糖尿病心肌病变的调控作用

张 凌，张 旋，程 峣，廖 鑫

遵义医科大学附属医院内分泌科 贵州遵义 563003

糖尿病是一种慢性病，发病率呈逐年增长趋势[1]。糖尿病心肌病是常见的糖尿病并发症，其发病机制与心肌细胞损伤密切相关[2]。目前，糖尿病心肌病尚缺乏高效的治疗方法[3]。探究影响心肌细胞损伤的分子机制，可为糖尿病心肌病的治疗提供新途径。miRNA是一类内源性小分子RNA，可靶向调控其靶基因的表达，参与多种心肌疾病的发生发展[4]。有报道[5]称，miR-1306-5p在心力衰竭患者的心肌组织中高表达。水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP1)是与转运水相关的同源性内在膜蛋白，参与调控细胞增殖、凋亡和侵袭等[6]。有研究[7]表明，糖尿病大鼠心肌组织中AQP1表达下降，上调AQP1表达可缓解糖尿病心肌病变。本研究通过体外培养人心肌细胞AC16，探究miR-1306-5p能否靶向作用于AQP1并调控高糖诱导的AC16细胞心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白的表达及凋亡，以期为糖尿病心肌病变的治疗提供新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1材料AC16细胞(中国科学院上海分院)，胎牛血清、DMEM培养基(Hyclone公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)，蛋白提取试剂盒、BCA蛋白试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，LipofectamineTM2000转染试剂(Santa Cruz公司)，ECL发光液(R&D公司)，AQP1、心房利钠因子(ANF)、肌球蛋白重链β(β-MHC)、转化生长因子-β(TGF-β)、Bax、Bcl-2一抗(CST公司)，二抗(博奥森生物技术有限公司)。

1.2高糖对AC16细胞心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白、miR-1306-5p和AQP1表达的影响AC16细胞于含体积分数10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基、体积分数5%CO2、37 ℃条件下培养。取对数生长期的AC16细胞，以每孔2.5×104个接种于24孔板。细胞生长密度达约60%时，吸弃培养基，加入不含胎牛血清的DMEM培养基。对照组细胞用含5 mmol/L葡萄糖的培养基孵育24 h，高糖(HG)组用含33 mmol/L葡萄糖的培养基孵育24 h。

收集细胞上清液，混匀，采用全自动生化分析仪测定肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。

采用Western blot法检测心肌病变相关蛋白(ANF、β-MHC和TGF-β)及AQP1的表达。提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜；体积分数5%牛血清白蛋白室温封闭1 h；加一抗(ANF、β-MHC、TGF-β及AQP1抗体均按1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜，TBS清洗3次，5 min/次；加二抗摇床孵育1 h，TBS清洗3次，5 min/次；ECL显影液显色，AI600凝胶成像仪观察，采集图片，以目的蛋白条带与β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

Trizol法提取细胞总RNA，取1 μg，反转录为cDNA后进行PCR扩增。miR-1306-5p上游引物5’-GGCTGTTTCTGGCTGTTACTG-3’，下游引物5’-AACACCCATTCCCTTCACAG-3’；U6上游引物5’-ATGTACGTAGCCATCCAGGC-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；AQP1上游引物5’-CCGAGACTTAGGTGGCTCAG-3’，下游引物5’-ATGCG GTCTGTAAAGTCGCT-3’；β-actin上游引物5’-AC CACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物5’-TC CACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反应体系：2×SYBR Mix 10 μL，10×cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，H2O 8.0 μL；反应程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。分别以U6、β-actin为内参，采用 2-ΔΔCt法计算miR-1306-5p、AQP1 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.3抑制miR-1306-5p表达对高糖处理的AC16细胞心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白表达、细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响AC16细胞同上培养，均以每孔2.5×104个接种于24孔板。高糖处理24 h后分为3组，HG组、HG+anti-miR-con组和HG+anti-miR-1306-5p，后2组高糖处理后参照lipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别转染miR-1306-5p抑制剂阴性对照(anti-miR-con)和miR-1306-5p抑制剂(anti-miR-1306-5p),均由美国Ambion®Life Technologies公司合成。转染后6 h更换新鲜培养基继续培养48 h。收集各组细胞，同上检测心肌酶的分泌及心肌病变相关蛋白的表达。

另取3组细胞约5×106个，1 000 r/min离心5 min，弃去培养基；PBS清洗1次，4 ℃、体积分数70%乙醇固定1～2 h，弃去固定液，PBS清洗；1 mL PI染液染色，4 ℃避光孵育30 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡。

采用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达(一抗按1∶500稀释)，方法同上。实验均重复3次。

1.4miR-1306-5p与AQP1靶向关系的测定用TargetScan生物信息学软件预测miR-1306-5p与AQP1 3’UTR的结合位点。采用双荧光素酶报告实验测定miR-1306-5p与AQP1的靶向关系。构建野生型AQP1 3’UTR(AQP1 3’UTR-WT)和突变型AQP1 3’UTR(AQP1 3’UTR-MUT)质粒，采用LipofectamineTM2000分别将miR-con、miR-1306-5p与AQP1 3’UTR-WT、AQP1 3’UTR-MUT质粒共转染至AC16细胞。转染48 h后使用荧光检测仪检测荧光强度，以海肾荧光酶活性为内参。同时取AC16细胞常规培养，高糖处理24 h后分为4组，分别转染miR-con、miR-1306-5p、anti-miR-con和anti-miR-1306-5p，48 h后采用Western blot法检测AQP1蛋白的表达。实验均重复3次。

1.5同时抑制miR-1306-5p和AQP1表达对高糖处理的AC16细胞心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白表达、细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响AC16细胞同上培养，均以每孔2.5×104个接种于24孔板。高糖处理24 h后分为4组，HG+anti-miR-con组、HG+anti-miR-1306-5p组、HG+anti-miR-1306-5p+si-con组和HG+anti-miR-1306-5p+si-AQP1组，分别转染anti-miR-con、anti-miR-1306-5p、anti-miR-1306-5p与乱序无意义阴性序列以及anti-miR-1306-5p与AQP1小干扰RNA(si-AQP1)。转染后6 h更换新鲜培养基。继续培养48 h后同上检测心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白的表达、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达。实验均重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。对照组和HG组AC16细胞心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白、miR-1306-5p和AQP1表达水平的比较采用两独立样本t检验；多组间AC16细胞心肌酶的分泌、凋亡率、凋亡相关蛋白及心肌病变相关蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1高糖对AC16细胞心肌酶的分泌及心肌病变相关蛋白、miR-1306-5p和AQP1表达的影响与对照组比较，HG组CK、LDH、AST水平，ANF、β-MHC、TGF-β蛋白表达水平升高(P<0.05)，说明高糖会对AC16细胞造成一定程度的损伤，且可诱导AC16细胞病变。与对照组比较，HG组miR-1306-5p表达升高，AQP1 mRNA和蛋白的表达降低(图1、表1)。

1：对照组；2：HG组

表1 2组细胞心肌酶分泌、心肌病变相关蛋白、miR-1306-5p和AQP1表达水平的比较(n=3)

2.2抑制miR-1306-5p对高糖诱导的AC16细胞心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白表达、细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响与HG组和HG+anti-miR-con组比较，HG+anti-miR-1306-5p组AC16细胞心肌酶的分泌减少，心肌病变相关蛋白的表达降低，凋亡率和Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)(图2、3和表2)。

2.3miR-1306-5p与AQP1靶向关系的预测和验证结果miR-1306-5p与AQP1 3’UTR结合位点的预测结果见图4。双荧光素酶报告实验结果见表3。miR-1306-5p与AQP1 3’UTR-WT共转染的细胞荧光素酶活性降低，而与AQP1 3’UTR-MUT共转染的细胞荧光素酶活性无明显变化，提示miR-1306-5p与AQP1 3’UTR有靶向关系。HG+miR-con组、HG+miR-1306-5p组、HG+anti-miR-con组、HG+anti-miR-1306-5p组AQP1蛋白的表达见图5，其水平分别为(1.00±0.15)、(0.39±0.06)、(1.00±0.14)和(2.13±0.17)，4组间比较，差异有统计学意义(F=254.381，P<0.001)；HG+miR-1306-5p组AQP1蛋白表达水平低于HG+miR-con组，HG+anti-miR-1306-5p组AQP1蛋白表达水平高于HG+anti-miR-con组，进一步证实miR-1306-5p负调控AQP1蛋白的表达。

1：HG组；2：HG+anti-miR-con组；3：HG+anti-miR-1306-5p组

1：HG组；2：HG+anti-miR-con组；3：HG+anti-miR-1306-5p组

表2 3组细胞心肌酶分泌、心肌病变相关蛋白表达、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的比较(n=3)

图4 miR-1306-5p与AQP1 3’UTR结合位点

表3 双荧光素酶报告实验结果(n=3)

1:HG+miR-con组;2:HG+miR-1306-5p组;3:HG+anti-miR-con组;4:HG+anti-miR-1306-5p组

2.4同时抑制miR-1306-5p和AQP1的表达对高糖处理的AC16细胞心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白表达、细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响见图6、7，表4。与HG+anti-miR-1306-5p+si-con组比较，HG+anti-miR-1306-5p+si-AQP1组CK、LDH和AST水平及ANF、β-MHC和TGF-β蛋白表达水平升高，凋亡率和Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，说明抑制AQP1的表达可逆转抑制miR-1306-5p对心肌病变的保护作用。

1：HG+anti-miR-con组；2：HG+anti-miR-1306-5p组；3：HG+anti-miR-1306-5p+si-con组；4：HG+anti-miR-1306-5p+si-AQP1组

表4 同时抑制miR-1306-5p和AQP1的表达对高糖诱导的AC16细胞心肌酶分泌、心肌病变相关蛋白表达、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响(n=3)

3 讨论

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并发症之一，具有较高的发病率和死亡率，严重威胁人类生命健康[8-9]。尽管糖尿病心肌病的治疗取得了较大进展，但仍存在一定缺陷，如治疗药物副作用较大[10]。因此，仍需要探究糖尿病心肌病的发生发展机制并寻找新的治疗靶点。研究[11]显示，糖尿病心肌病的发病机制与心肌细胞的损伤密切相关。高糖可引起细胞线粒体膜电位异常，导致心肌细胞损伤，降低高糖诱导的心肌细胞损伤对于糖尿病心肌病的治疗具有重要意义[12]。心肌损伤时，心肌酶CK、LDH和AST的表达升高[13]。ANF、β-MHC、TGF-β是心肌细胞肥大相关因子。齐迎春等[14]研究显示，大鼠肥厚心肌组织中ANF、β-MHC、TGF-β高表达，沉默其表达可以抑制心肌细胞肥大。本研究结果显示，高糖处理后心肌细胞AC16中心肌酶CK、LDH和AST的分泌增加，心肌病变相关蛋白ANF、β-MHC和TGF-β蛋白的表达水平升高，说明高糖诱导的心肌细胞损伤模型成功建立。

miRNA是真核生物中广泛存在的一类小分子非编码RNA，可通过调控其靶基因的表达影响心肌细胞的生命活动[15]。Song等[16]的研究显示，miR-144通过靶向CTRP3/JNK信号通路调控高糖诱导的心肌细胞AC16增殖和凋亡，可作为糖尿病心肌病的治疗靶点。Cheng等[17]的研究显示，lncRNA Malat1的敲低可通过促进miR-181a-5p表达来减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡。另有报道[5]，心力衰竭患者心肌组织中miR-1306-5p呈高表达。但目前，miR-1306-5p在糖尿病心肌病中的作用还未知。本研究结果显示，高糖可促进心肌细胞AC16中miR-1306-5p的表达，提示miR-1306-5p可能参与高糖作用后的心肌细胞病变；抑制miR-1306-5p表达可降低高糖诱导的心肌细胞中CK、LDH和AST的分泌及ANF、β-MHC和TGF-β蛋白的表达水平，说明抑制miR-1306-5p表达可减轻高糖诱导的心肌细胞损伤。心肌细胞凋亡在心肌病变中起重要作用。本研究显示，抑制miR-1306-5p的表达可显著减少细胞凋亡，减轻心肌细胞损伤。

为了进一步探讨抑制miR-1306-5p保护高糖作用下心肌细胞的作用机制，本研究通过双荧光素酶基因报告实验和Western blot证实了miR-1306-5p在心肌细胞中靶向负调控AQP1表达，这也与高糖促进miR-1306-5p表达而抑制AQP1表达的结果一致。研究[18]显示，AQP1在缺血缺氧小鼠心肌细胞中表达降低，参与心肌损伤的发生发展。本研究结果显示，抑制AQP1表达减弱了抑制miR-1306-5p表达对高糖诱导的心肌细胞的保护作用，表现为CK、LDH、AST的分泌增多，ANF、β-MHC、TGF-β、Bax蛋白表达升高，心肌细胞凋亡增加，提示抑制miR-1306-5p表达可能通过靶向上调AQP1的表达发挥保护心肌细胞的作用。

综上所述，高糖可损伤心肌细胞，抑制miR-1306-5p表达可能通过靶向上调AQP1表达减轻高糖对心肌细胞的损伤，为靶向治疗糖尿病心肌病变提供了新思路。