萝卜硫素预处理通过TLR4/MyD88/NF-κB通路对缺氧/复氧大鼠心肌细胞的保护作用

李云鹏，杨玉丹

1)郑州大学第一附属医院心血管内科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052

随着冠脉介入技术及抗栓药物的发展，缺血性心血管疾病的病死率得到了很大提高，但心肌梗死后心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤仍然难以避免，I/R损伤致心肌梗死后心室重构，导致患者生活质量下降，甚至死亡[1]。心肌I/R损伤是一系列炎症反应、氧化应激、凋亡和自噬等机制参与的复杂的病理生理变化过程[2]。研究[3]表明，急性炎症反应在I/R早期阶段起了关键作用，抑制过度炎症反应可改善受损心功能，所以，控制炎症是一种较好的改善心肌I/R损伤的治疗策略，为临床治疗心肌I/R损伤提供了方向。萝卜硫素是由硫甙衍生而来的一种异硫氰酸盐，大量存在于芸苔属植物中，具有抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤的作用[4]。作者前期研究[5]发现萝卜硫素能改善缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)所导致的心肌损伤，但具体作用机制尚不明确。本研究通过建立离体心肌H/R损伤模型模拟在体I/R损伤，观察萝卜硫素是否通过抑制炎症来减轻心肌细胞H/R损伤及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料萝卜硫素(美国Sigma-Aldrich公司，货号：S6317-5 mg)，乳酸脱氢酶(LDH)ELISA试剂盒(美国Biovision公司)，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及β-actin抗体(美国Abcam公司)。SD大鼠乳鼠购自郑州大学实验动物中心[合格证号SYXK(豫)2019-0002]。

1.2原代心肌细胞培养和H/R模型制作参考既往文献[5-6]分离SD大鼠乳鼠原代心肌细胞并制作H/R模型。H/R条件：将含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基更换为不含血清的无糖DMEM培养基，用95%N2充入H/R培养箱内先排空空气，37 ℃培养3 h后将培养基更换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数20%O2、5%CO2环境培养3 h。

1.3不同浓度萝卜硫素预处理对H/R心肌细胞形态、存活率和LDH分泌的影响大鼠原代心肌细胞分为5组。正常对照组：原代心肌细胞正常培养；H/R 组：给予缺氧3 h/复氧3 h处理；低、中、高浓度萝卜硫素组：缺氧前1 h分别给予0.1、1.0、5.0 μmol/L萝卜硫素预处理，然后建立H/R模型。倒置显微镜下观察细胞形态。

细胞存活率检测：将原代心肌细胞接种于96孔板，每孔接种104个细胞。分组处理完成后，置于体积分数5%CO2、37 ℃培养箱继续培养24 h，每孔加入20 μL MTS(美国Promega公司)继续培养4 h显色，用酶标仪检测490 nm波长处吸光度。细胞存活率=实验组吸光度/空白对照孔吸光度。

LDH活性检测：收集各组细胞培养液上清，应用ELISA试剂盒检测LDH活性，具体步骤参考试剂盒说明书。以上实验重复3次。

1.4萝卜硫素对H/R心肌细胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌和胞内TLR4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白表达的影响另取大鼠原代心肌细胞接种于6孔板，每孔接种2×106个。分为3组，正常对照组、H/R组、萝卜硫素组，前2组同上处理，萝卜硫素组于缺氧前1 h给予5.0 μmol/L萝卜硫素预处理，然后建立H/R模型。

收集各组细胞培养液上清，应用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-6、IL-1β浓度，具体步骤参照试剂盒说明书。

收集各组细胞提取总蛋白，上样、SDS-PAGE电泳、转膜，50 g/L脱脂奶粉溶液封闭后，加TLR4抗体(按1∶500稀释)，MyD88、p-NF-κB p65和β-actin抗体 (均按1∶10 000稀释)，4 ℃孵育，摇床过夜；加相应二抗(按1∶8 000稀释)，室温孵育2 h，洗膜。ECL发光，使用凝胶图像分析系统检测。以目的蛋白条带和β-actin条带灰度值的比值为目的蛋白的表达量。以上实验重复3次。

1.5统计学处理应用SPSS 20.0处理数据。采用单因素方差分析比较5组心肌细胞存活率和LDH分泌水平，以及3组心肌细胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达水平的差异，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同浓度萝卜硫素预处理对H/R心肌细胞形态、存活率及LDH分泌的影响正常对照组心肌细胞存活状态良好，搏动有力并呈一致性；H/R组存活心肌细胞减少，细胞搏动无力，节律改变；低、中、高浓度萝卜硫素组存活细胞较H/R组增多，细胞搏动转好，高浓度(5.0 μmol/L)效果最好(图1)。

与正常对照组对比，H/R组心肌细胞存活率下降，细胞损伤和活性指标LDH分泌水平升高(P<0.05)；与H/R组比较，中、高浓度萝卜硫素均可升高心肌细胞存活率，降低LDH分泌水平，尤以高浓度(5 μmol/L)效果更好(P<0.05)，因此后续实验选取5 μmol/L为萝卜硫素的作用浓度。见表1。

A、B、C、D、E：分别为空白对照组，H/R组和低、中、高浓度萝卜硫素组

表1 各组心肌细胞存活率及LDH分泌水平比较

2.2萝卜硫素预处理对H/R心肌细胞炎症因子分泌及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达水平的影响见表2。与正常对照组比较，H/R组炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β释放增多；与H/R组比较，萝卜硫素组炎症因子的释放减少(P<0.05)，表明萝卜硫素对H/R造成的炎症损伤具有改善作用。与正常对照组比较，H/R组心肌细胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白表达水平升高；而萝卜硫素预处理则可以减弱上述效应(P<0.05)。

表2 各组心肌细胞炎症因子分泌及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达水平比较

3 讨论

在心肌I/R损伤初期，细胞损伤表现为炎症反应，最终导致心室重构，发生心功能障碍[7-8]；而促炎分子机制尚未完全阐明，所以研究I/R损伤过程中炎症的预防治疗十分有意义。研究[9]表明，右旋美托咪啶预处理通过抑制HMGB1蛋白的表达而减少细胞坏死性凋亡，改善心肌细胞H/R损伤。另有学者[10]研究发现，天然的黄酮刺槐素能够减轻心肌细胞H/R损伤，其机制是通过AMPK介导的Nrf2激活，之后参与一系列抗炎、抗氧化、抗凋亡的细胞内信号而发挥作用。

研究[4]表明萝卜硫素具有抗炎、抗氧化等多种生物学效应。在本实验中，我们首先设置不同浓度萝卜硫素处理探索最佳的药物浓度，结果显示H/R后心肌细胞搏动变差，存活率下降，LDH活性显著增高，提示造模成功，而给予中、高浓度萝卜硫素处理后，心肌细胞搏动增强，存活率升高，LDH活性下降，表明萝卜硫素可以改善H/R心肌细胞损伤，且5 μmol/L效果更好。进一步研究发现，H/R组造模后，细胞培养液上清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，表明H/R后心肌细胞发生炎症反应，应用萝卜硫素处理后上述炎症因子下降，表明炎症受到抑制。

TLR4影响多种生理、病理过程的基因调控，在介导炎症反应中起着重要作用[11]。MyD88是TLR信号通路中的重要分子，参与炎症的发生发展；NF-κB p65是TLR4的下游效应因子，TLR4可通过配体与MyD88结合，引起NF-κB p65从细胞质到细胞核转位，然后NF-κB p65与DNA结合并参与IL-1β、IL-6和TNF-α多种细胞因子的转录[12]。故TLR4/NF-κB p65信号通路在炎症信号的传递中发挥着重要作用。有学者[13]研究发现，鹰嘴豆芽素A能够通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路介导的炎症途径减轻心肌H/R损伤。在本研究中，H/R能诱导TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达增强，萝卜硫素处理后，三者表达均下降，表明萝卜硫素可能是通过TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制炎症从而减轻心肌H/R损伤，确切机制尚需要进一步探讨。