银杏黄酮苷元通过调控DUSP1表达对急性胰腺炎大鼠腺泡细胞炎症因子分泌和凋亡的影响

杜健磊,王俊苹,刘 伟

1)驻马店市中心医院药学部 河南驻马店 463000 2)新乡医学院第三附属医院临床药学室 河南新乡 453003

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是多种病因引起的急腹症，发病机制复杂，炎症介质、胰腺腺泡细胞钙超载等均与其发病有关[1-2]。研究[3]表明中药治疗AP疗效确切，可降低病死率。黄酮类化合物主要以游离的苷元或糖结合的苷类形式存在于植物体内，黄酮苷元比结合型糖苷具有更强的抗炎、抗氧化功能[4]。银杏黄酮苷元(ginkgo flavone aglycone，GA)是银杏叶提取物中的黄酮苷通过化学修饰去除糖基后获得的新型物质，研究[5]认为GA对脑缺血和动脉粥样硬化具有较好的防治作用。GA通过NF-κB信号通路减弱心肌缺血再灌注损伤中的细胞凋亡和炎症反应[6]。双特异性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1，DUSP1)也称为丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP1)。研究[7]表明沉默DUSP1可通过激活AP小鼠血清中的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路来促进促炎细胞因子的释放[8]。本实验用雨蛙素刺激大鼠胰腺腺泡AR42J细胞制备AP腺泡模型细胞[8]，观察GA对AP腺泡细胞炎症因子分泌和凋亡的影响，探讨其机制是否与DUSP1有关。

1 材料与方法

1.1细胞株与主要试剂大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J购自上海圻明生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培养基购自上海联硕生物科技有限公司；雨蛙素购自美国Sigma公司；GA由贵州省生化中心何照范教授惠赠；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；ELISA试剂盒购自上海博湖生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海科敏生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒购自苏州瑞诺德生物科技有限公司；qRT-PCR检测试剂盒购自北京绿源伯德生物科技有限公司。兔源Bax、Bcl-2和DUSP1抗体为美国Abcam公司产品。

1.2AP腺泡细胞模型的建立AR42J用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养，每天换液1次，细胞融合至80%左右进行传代。取对数生长期细胞，加入100 nmol/L雨蛙素刺激6 h，细胞凋亡增加及IL-6、TNF-α水平升高表明AP腺泡细胞模型成功建立[9]。

1.3细胞处理与分组①正常培养的AR42J细胞作为空白对照组，按1.2处理的细胞为AP组，以用15、30、60 mg/L GA处理48 h的模型细胞作为GA低、中、高浓度组。②将pcDNA、pcDNA-DUSP1转染至AR42J细胞6 h后，再用100 nmol/L雨蛙素刺激6 h，分别作为AP+pcDNA组、AP+pcDNA-DUSP1组。③将si-NC、si-DUSP1转染至AR42J细胞6 h后，再用100 nmol/L雨蛙素和60 mg/L的GA处理48 h，分别作为AP+GA+si-NC组、AP+GA+si-DUSP1组，另取模型细胞作为AP组，用100 nmol/L雨蛙素和60 mg/L的GA处理48 h的细胞作为AP+GA组。具体转染方法按LipofectamineTM2000转染试剂盒说明操作。

1.4ELISA法检测IL-6、TNF-α分泌水平细胞培养48 h后，取培养上清，采用ELISA试剂盒进行IL-6和TNF-α水平检测。实验重复3次。

1.5Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况细胞分组处理后用预冷的PBS漂洗2次，先加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.6Western blot法检测Bcl-2、Bax、DUSP1蛋白表达收集各组细胞，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。取50 μg蛋白样品于100 g/L的SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，用50 g/L的牛血清蛋白封闭1 h。加入一抗(均按照1∶1 000稀释)4 ℃过夜，TBST洗膜3次；加入二抗室温培养1 h，再用TBST洗涤3次，加入化学发光试剂显影，用Image J软件分析，用目的蛋白和内参GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白表达水平。每个蛋白样品设3个重复，实验重复3次。

1.7qRT-PCR法检测DUSP1mRNA的表达提取空白对照组，AP组，GA低、中、高浓度组细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，按照试剂盒使用说明进行PCR，以GAPDH为内参。DUSP1上游引物序列：5’-CCCTGAGTACTAGCGTCCCT-3’，下游引物序列：5’-GGCCACCCTGATCGTAGAGT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TCCTGTTCGACAGTCAGCCGCA-3’，下游引物序列：5’-ACCAGGCGCCCAATACGAC CA-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量用2-ΔΔCt法计算。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 20.0进行分析，AP+pcDNA和AP+pcDNA-DUSP1组间各指标比较行两独立样本t检验，其他多组间各指标比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.15组AP细胞上清中IL-6、TNF-α分泌水平结果见表1。

表1 5组AP细胞IL-6、TNF-α水平比较(n=3) ng/L

2.25组细胞的凋亡情况结果见表2。

2.35组AP细胞中DUSP1的表达结果见表3。

表2 5组细胞凋亡情况比较(n=3)

表3 5组细胞中DUSP1表达的比较(n=3)

2.4AP+pcDNA组和AP+pcDNA-DUSP1组细胞检测指标比较结果见表4。与AP+pcDNA组比较，AP+pcDNA-DUSP1组DUSP1蛋白表达水平升高，上清中IL-6、TNF-α水平降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高。

2.54组AP细胞检测指标比较结果见表5。与AP组比较，AP+GA组DUSP1表达水平升高，IL-6、TNF-α水平降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高；与AP+GA和AP+GA+si-NC组比较，AP+GA+si-DUSP1组DUSP1表达水平降低，IL-6、TNF-α水平升高，细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低。

表4 AP+pcDNA组和AP+pcDNA-DUSP1组细胞检测指标比较(n=3)

表5 4组AP腺泡细胞检测指标比较(n=3)

3 讨论

AP根据严重程度分为轻症、中症和重症。轻症AP较为常见，且预后良好；但重症AP病情多变，致死率高；炎症因子及细胞凋亡在其发生发展中起重要作用；AP中胰腺损伤主要表现为腺泡细胞的凋亡和坏死，坏死的细胞会释放大量炎症因子，AP的严重程度与胰腺腺泡细胞凋亡呈负相关；诱导细胞凋亡可在一定程度上减轻AP[9-10]。研究[11]表明中药治疗AP临床疗效较好应。有研究[12]报道GA可通过调节信号转导子和转录激活子3(STAT3) / Janus激酶2(JAK-2)/ sirtuin-1(SIRT-1)减轻缺血性中风大鼠的神经炎症和神经元损伤。GA可通过减弱体内炎症反应、肾损伤以及肾小管凋亡来保护小鼠免受脂多糖诱导的急性肾脏损伤[13]。本研究结果显示，雨蛙素诱导的AR42J细胞分泌IL-6、TNF-α水平降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高；提示GA可抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞炎症因子的释放以及促进腺泡细胞凋亡，表明GA可能减轻AP严重程度。

且本实验还发现雨蛙素处理大鼠胰腺腺泡细胞AR42J中DUSP1表达水平降低。说明DUSP1可能参与了AP的进展。已有研究[14]报道沉默DUSP1可促进AP小鼠促炎细胞因子的释放。且还有研究[15]报道DUSP1可保护JAK2V617F驱动的真性红细胞增多症祖细胞免受炎症应激和DNA损伤。MKP-1可调节LPS诱导的促炎性巨噬细胞活化和炎症反应[16]。DUSP1在心肌缺血再灌注损伤中表达下调，上调其表达可减轻缺血再灌注诱导的心肌损伤[17]。本研究结果显示，过表达DUSP1可降低雨蛙素诱导的AR42J细胞炎症因子水平，促进细胞凋亡。本实验还发现AP+GA组细胞中DUSP1表达水平升高，IL-6、TNF-α水平降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达降低，Bax表达升高，而干扰DUSP1表达逆转了GA对雨蛙素诱导的AP腺泡细胞炎症因子和凋亡的影响，提示GA对雨蛙素诱导的AP腺泡细胞炎症因子和凋亡的影响与DUSP1表达有关。

综上所述，GA可通过上调DUSP1表达抑制雨蛙素诱导的AP腺泡细胞炎症反应，促进细胞凋亡。