细胞色素P450 2A13野生型/突变体稳定表达Flp-InTM CHO细胞系的建立

郑丹丹，李 靖，王永林，李勇军，刘 亭

1)贵州医科大学基础医学院病理生理学教研室 贵阳 550025 2)贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室 贵阳 550004 3)贵州医科大学药学院 贵阳 550025 4)贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心 贵阳 550004

细胞色素P450家族2亚家族A成员13(CYP2A13)是最近研究发现的比较重要的一类CYP450，其表达有组织特异性，主要在人肺部、支气管以及鼻咽喉等呼吸道组织中表达[1-2]。研究[1-2]表明，烟草特异性致癌物4-甲基亚硝胺-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)以及黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)等环境致癌物可被CYP2A13高效代谢活化，并且CYP2A13遗传多态性可影响人体环境毒物敏感性。

在CYP2A13已报道的单核苷酸多态性(SNP)位点中，有9个位于外显子区域，共产生8种突变体，分别是CYP2A13*2、*3、*4、*5、*6、*7、*8和*9，其中*3、*4和*7突变体均无活性，而*2、*5、*6、*8和*9突变体具有代谢活性，并能引起NNK相关肺癌易感性的个体差异[3-4]。本文拟构建稳定表达CYP2A13*1(野生型)、*2、*5、*6、*8和*9的Flp-InTMCHO细胞系，为体外研究CYP2A13多态性对人体环境毒物敏感性的影响提供工具。

1 材料与方法

1.1主要材料pcDNA5/FRT载体、Flp-InTMCHO细胞系由浙江大学陈枢青教授免费赠送。pOG44质粒，含CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9基因片段的pGEM-T重组质粒由本实验室保存。HindⅢ、NotⅠ、T4等工具酶均购自Invitrogen公司；Ham′s F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Trizol试剂购自Gibco公司；TOP10感受态细菌、氨苄青霉素、潮霉素B、质粒提取试剂盒、ECL Plus超敏发光液、RIPA裂解液均购自索莱宝公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体、兔抗CYP2A13抗体均购自Abcam公司；AFB1购自Sigma公司；MTS、FuGENE6转染试剂购自Promega公司；荧光定量试剂盒、反转录试剂盒购自TaKaRa公司。PCR引物由上海恒英公司合成，引物如下：GAPDH上游引物为5’-GAGTCAACG GATTTGGTCGT-3’，下游引物为5’-GACAAGCTTC CCGTTCTCAG-3’；CYP2A13上游引物为5’-CCTG GTGATGACCACCC-3’，下游引物为5’-CGTGGAT CACTGCCTCTG-3’。多功能酶标仪购自Thermo Scientific公司；凝胶成像仪购自Bio-Rad公司。

1.2pcDNA5-CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9重组质粒的构建分别将pGEM-CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9等质粒用HindⅢ和NotⅠ双酶切，切胶回收CYP2A13片段，并用T4连接酶连接CYP2A13片段和pcDNA5/FRT的HindⅢ和NotⅠ酶切产物。用连接产物转化TOP10感受态细菌，挑取克隆培养并抽提质粒，通过HindⅢ和NotⅠ双酶切验证，挑选出阳性克隆进行测序，测序正确的克隆于-80 ℃保存。

1.3pcDNA5-CYP2A13转染CHO细胞系用含500 mg/L博来霉素的Ham′s F12完全培养基(含体积分数10%胎牛血清)在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养Flp-InTMCHO细胞。细胞生长至约80%融合时，用胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化计数，转至6孔板中，待细胞长至70%融合，用0.3 μg pcDNA5-CYP2A13质粒及5 μg pOG44质粒与10 μL FuGENE6混合物转染细胞。转染24 h后用含600 mg/L潮霉素B的Ham′s F12完全培养基培养4周，筛选候选阳性克隆，并用含500 mg/L博来霉素的Ham′s F12完全培养基来验证候选阳性克隆的博来霉素敏感性，得到阳性克隆。阳性克隆继续以含600 mg/L潮霉素B的Ham′s F12完全培养基维持培养。用pcDNA5/FTR空载体转染细胞作为阴性对照。

1.4CYP2A13mRNA表达水平的检测取以上方法构建的阴性对照细胞(vehicle-CHO)和各CYP2A13-CHO细胞系进行CYP2A13 mRNA测定。利用Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录成cDNA。反应体系：1.0 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，10 μL SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以GAPDH为内参，通过2-ΔΔCt法计算目的mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.5CYP2A13蛋白表达水平的检测利用RIPA裂解液提取vehicle-CHO和各CYP2A13-CHO细胞系总蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将20 μg等量蛋白变性后进行SDS-PAGE，然后将蛋白转印至PVDF膜，胎牛血清封闭2 h。一抗(兔抗CYP2A13多克隆抗体，稀释度1∶100；小鼠抗β-actin单克隆抗体，稀释度1∶5 000)4 ℃孵育过夜；洗膜后，二抗(稀释度1∶2 000)室温孵育2 h。用ECL Plus超敏发光试剂盒进行检测，凝胶成像仪系统成像，使用Quantity One软件进行灰度值分析，以目的蛋白与内参β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.6AFB1对CYP2A13-CHO的细胞毒性用培养基将细胞密度调整为1.5×105个/mL，然后转至96孔板中，每孔加入100 μL，培养24 h。空白组用含体积分数0.1%DMSO的完全培养基处理细胞，各实验组细胞给予AFB1(200 mg/L)处理24 h后，加入MTS溶液(100 μL Ham′s F12加入5 μL MTS)孵育2 h。使用多功能酶标仪测定490 nm处的吸光度(A)值，按下列公式计算细胞存活率：存活率=(A实验组-A培养基/A空白组-A培养基)×100%。实验重复3次。

1.7统计学处理用SPSS 18.0进行统计分析。不同组间CYP2A13 mRNA及蛋白相对表达量、细胞存活率的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1pcDNA5-CYP2A13质粒的鉴定琼脂糖凝胶电泳结果显示，阳性克隆经过HindⅢ和NotⅠ酶切后，出现了一条1 500 bp左右的条带(图1)。将阳性克隆测序，结果与GenBank报道的CYP2A13基因(NG_007928)序列一致，说明质粒构建成功。

2.2CYP2A13-CHO细胞模型的鉴定相比vehicle-CHO组细胞，各CYP2A13-CHO组中CYP2A13 mRNA和蛋白表达水平上升，细胞存活率降低(图2，表1)。

M：DL15000 DNA Marker；1、2：pcDNA5-CYP2A13*1及其酶切；3、4：pcDNA5-CYP2A13*2及其酶切；5、6：pcDNA5-CYP2A13*5及其酶切；7、8：pcDNA5-CYP2A13*6及其酶切；9、10：pcDNA5-CYP2A13*8及其酶切；11、12：pcDNA5-CYP2A13*9及其酶切

1～6：CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8、*9-CHO组；7：vehicle-CHO组

表1 各组细胞CYP2A13 mRNA及蛋白相对表达量、细胞存活率的比较(n=3)

3 讨论

Flp-InTMCHO细胞基因组引进了一个Flp重组酶的作用靶点(FLP recombination target，FRT)，表达载体中的目的基因通过Flp重组酶介导后，定点整合至FRT位点[5-6]。使用该细胞构建的转基因细胞系有两个优点：该系统可实现定点插入、蛋白表达量一致，可以保证不同突变体蛋白表达量一致，便于进行活性比较；将带有目的基因的pcDNA5/FRT载体与pOG44载体共转染Flp-InTMCHO宿主细胞，通过潮霉素B筛选28 d左右便可得到稳定转染细胞系且不需单克隆筛选，耗时短，工作量少[5-6]。故本文采用Flp-InTMCHO细胞进行CYP2A13野生型和突变体稳定表达细胞的构建。

SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是CYP450遗传多态性的主要存在形式，其可产生多种突变体，且某些SNP可以改变基因表达或酶蛋白中氨基酸的组成，从而影响CYP450的合成和活力。CYP2A13可代谢激活AFB1等环境毒物，导致细胞DNA损伤进而促进细胞癌变，对CYP2A13各SNP突变体进行功能性研究，将为筛选环境致癌物易感人群提供重要的理论指导[7-8]。

在已报道[3-4]的CYP2A13的SNP中，CYP2A13*3、*4和*7均不表现出酶活性。故本实验只建立了表达CYP2A13野生型(CYP2A13*1)/突变体(CYP2A13*2、*5、*6、*8和*9)Flp-InTMCHO细胞系。实验表明，和转染空载体的CHO细胞相比，转染各个CYP2A13野生型和突变体的细胞中CYP2A13 mRNA和蛋白表达水平均增加，并且体现出较强的AFB1敏感性，说明成功构建了CYP2A13稳定表达的Flp-InTMCHO细胞系。但是CYP2A13野生型和突变体表达细胞对AFB1敏感性差异不大。AFB1可被人体吸入，在体内经过代谢活化，产生AFB1-8,9-环氧化物，表现出强毒性和致癌性[9]。以上结果表明，作为主要表达在人呼吸道中的AFB1优势代谢酶，CYP2A13的SNP多态性可能不会导致人体对AFB1敏感性的变化[10]。

综上所述，本研究建立了稳定表达CYP2A13野生型和各突变体的Flp-InTMCHO细胞系，目的蛋白均能均一表达并发挥活性。以上工作为研究CYP2A13介导的环境毒物敏感性差异机制提供了实验工具。