胎盘间充质干细胞对大鼠子宫切口瘢痕缺陷的修复作用

孙文静，胡孟彩，高 翔，樊 荣

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州450052

剖宫产术引起的切口瘢痕缺陷严重影响女性生殖健康和生存质量。剖宫产子宫切口瘢痕缺陷(previous cesarean scar defect，PCSD)的发生机制复杂，临床上尚无很好的医治方法，目前常用的方法有激素治疗和手术治疗，主要以改变症状为主，因此探索高效且能预防以及迅速修补PCSD的方法非常重要[1]。研究[2-3]证实，胎盘间充质干细胞(placental mesenchymal stem cell，PMSc)在特定环境下能够诱导分化为子宫平滑肌细胞，且骨髓和脐带的间充质干细胞已用于子宫损伤修复的研究。本研究观察了PMSc用于子宫切口瘢痕缺陷修复的效果，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料雌性SPF级SD大鼠50只，7～8周龄，体重(220±20) g，雄性SD大鼠25只，9～10周龄，体重(320±20) g，清洁级别。生产许可证号：SCXK(苏)2017-0001。饲养环境：室温22 ℃，通风，采光条件良好；大鼠采用专用笼喂养，给予专用饲料、专用水。实验中遵循国家制定的有关实验动物保护和使用指南。该研究获得郑州大学第三附属医院伦理委员会批准。PMSc凝胶购自北京汉氏联合生物技术有限公司，批号 CXSL1800117。

1.2大鼠PCSD制模方法通过预实验并参考文献[4]，在子宫切口的肌壁上注射LPS(1 g/L，1 mL/kg体重)，并应用电刀电凝切口两侧(功率为10 W)，5-0可吸收线间断缝合子宫切口，制作PCSD模型。

1.3实验动物的分组和处理将雌雄SD大鼠2∶1合笼，次日早晨行阴道分泌物涂片实验，镜下观察到有精子者记为受孕第1天。2只未受孕，余48只孕鼠随机分为4组，对照组、模型组、治疗A组、治疗B组，每组12只，均在孕第19天行剖宫取胎术。对照组：距离子宫颈分叉上方2 cm处行剖宫取胎术，纵向剪开子宫左侧系膜的对侧缘，取出全部鼠仔和胎盘，同法处理另一侧子宫后，逐层关腹;模型组：行剖宫取胎术后，采用1.2方法制作PCSD模型;治疗A组：造模后子宫切口局部均匀涂抹PMSc凝胶0.5 mL;治疗B组：造模后子宫切口肌层多点注射PMSc凝胶0.5 mL。剖宫取胎术后对照组大鼠死亡1只，模型组死亡2只，治疗A、B组各死1只，死亡原因为感染、出血。随机剔除对照组1只、治疗A组和治疗B组各1只，最终参与实验的大鼠为每组10只。实验第50天，处死大鼠，留取双侧子宫标本。每个标本随机收集子宫切口上、中、下3段组织各1块混合。

1.4瘢痕区域子宫肌层α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)检测切片常规脱蜡，置于蒸馏水中，流水冲洗1 min后用Weigert铁苏木素A、B液1∶1混合后，染色5～10 min，水洗，分别滴加1∶200稀释的α-SMA一抗、TGF-β1一抗50 μL(抗体均购自博奥森生物技术有限公司)，4 ℃过夜孵育，室温复温1 min，PBS冲洗,显色。复染、脱水、封片后制成永久性玻片标本用于观察。α-SMA、TGF-β1免疫组化染色阳性细胞为棕黄色颗粒。α-SMA阳性面积百分比：100倍镜下随机选取6个区域，计算机分析系统测得所选区域肌层α-SMA阳性面积与总面积的比值，取均值，同法获得TGF-β1阳性面积的百分比。

1.5子宫肌层厚度、内膜厚度及子宫内膜缺陷的检测取各组标本，常规行HE染色。用Image-Pro Plus计算机图像分析软件进行分析，50倍镜下评估子宫肌层的厚度；100倍镜下测量子宫肌层与内膜交界处至宫腔的垂直距离，即为子宫内膜厚度。子宫内膜缺陷：子宫内膜厚度为0。

1.6统计学处理应用SPSS 21.0处理数据。4组间各指标的比较用χ2检验或单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1子宫瘢痕区域HE染色结果对照组可见稀少的毛细血管，子宫肌层稍薄，分布有序，少数炎性细胞浸润。模型组瘢痕区域未见明显毛细血管，肌层变薄，肌纤维断裂、消失，内膜变薄，严重者上皮中断、不连续，大量炎性细胞浸润，甚至间质增生、水肿，肉芽组织形成。治疗A、B组情况相似，偶可见新生丰富的毛细血管，肌纤维排列整齐，肌层、内膜厚度较模型组厚，内膜中断情况改善。见图1上排。

A:对照组；B：模型组；C：治疗A组；D：治疗B组；1：HE染色结果；2：α-SMA蛋白；3：TGF-β1蛋白

2.2子宫瘢痕区域α-SMA、TGF-β1免疫组化染色结果对照组子宫瘢痕区域肌层内可见大量α-SMA阳性细胞，呈条索状、连续分布，与内膜的边界清楚。模型组α-SMA阳性细胞稀散分布，不连续，与内膜层的分界模糊。与模型组相比，治疗A、B组α-SMA阳性细胞明显增多，排列有序，与内膜层的分界清楚。4组瘢痕区域子宫肌层组织细胞浆及细胞膜中均可见TGF-β1蛋白呈棕黄色表达。见图1中排和下排。

2.34组大鼠子宫瘢痕区域各指标比较与对照组比较，模型组子宫瘢痕区域肌层厚度与内膜厚度、α-SMA阳性面积百分比均降低，TGF-β1阳性面积百分比、子宫内膜缺陷率升高；与模型组比较，治疗A、B组以上指标均有改善。见表1。

表1 4组大鼠子宫瘢痕区域各指标的比较

3 讨论

近年来，PMSc展示出巨大的应用前景[5]。目前多项研究[6-7]表明，PMSc具有分化为平滑肌细胞的潜力。在子宫瘢痕中，胶原纤维蛋白沉积是主要问题，它能够影响子宫天然细胞的增殖、分化和迁移。研究[8]显示，α-SMA与TGF-β1参与调节细胞外基质代谢、启动纤维化过程，是关键的细胞因子，主要通过调控成纤维细胞的分化促进纤维连接蛋白的合成与细胞间质的增生、抑制细胞外基质的分解，最终导致纤维化的发生。大鼠子宫在组织学上呈管腔状，从外向内依次为外膜、肌层和内膜。透明的浆膜层为外膜，薄如纸张，与肌层粘连紧密，不容易分离；由外纵内环构成的两层平滑肌为肌层，较厚，具有收缩能力，肌细胞排列有序，内可见血管、疏松的结缔组织；上皮和间质组成内膜，上皮是排列紧密的单层柱状上皮，呈褶皱状，间质含有单管状腺体。本研究结果显示，与对照组比较，模型组子宫瘢痕区域肌层变薄，肌纤维断裂，甚至缺损，胶原纤维增加；内膜层变薄，上皮缺陷严重；肌层厚度、内膜厚度、α-SMA阳性面积百分比均低于对照组，子宫内膜缺陷率高于对照组，证明模型构建成功，与罗惠娟等[9]研究结果一致。

Buhimschi等[10]的研究表明，子宫组织损伤后，必须恢复为原来的细胞、组织结构，方能恢复其本身的功能。本研究通过局部肌层多点注射移植和局部涂抹移植2种方式，初步探索PMSc凝胶对大鼠子宫切口瘢痕缺陷的预防和修复作用，结果显示，与模型组相比，治疗A组、治疗B组肌层厚度、α-SMA阳性面积百分比均较高，可见切口部位移植的PMSc有助于子宫平滑肌细胞的生长，促进该部位原有结构的恢复，推测与PMSc向子宫平滑肌细胞的分化有关，本研究结果与陈志文等[11]、韦伟等[12]的动物实验结果相似。治疗A、B两组之间对比，肌层厚度、α-SMA阳性面积百分比差异均无统计学意义。提示两种给药方法均可修复子宫切口瘢痕缺陷。

本研究结果还显示，模型组TGF-β1阳性面积百分比高于对照组，表明PCSD的发生与瘢痕纤维化密切相关，局部应用PMSc凝胶后，治疗A、B组的TGF-β1阳性面积百分比低于模型组，因此推断瘢痕区域TGF-β1表达的下降能够逆转瘢痕纤维化的形成，PMSc可能通过调控TGF-β1的水平，改善局部微环境，促进平滑肌细胞的再生，恢复瘢痕区域结构和功能的完整性。该研究后期还需要更多的实验进一步证实。本研究结果有望为临床上有效预防PCSD的发生提供思路和方法。