郁金散对大肠湿热证大鼠HPA轴的影响机制

董嘉琪，姚万玲，文艳巧，张旺东，张亚辉，魏彦明

(甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070)

大肠湿热证为兽医临床常见病证之一，主要由湿邪与热邪共同侵犯肠道以及病原微生物感染所致，以腹痛，泄泻，粪便黏腻色黄，体温升高，口渴喜饮，脉滑数，舌苔黄腻等为主要症状[1]。常见于现代医学中的急慢性肠炎、细菌性痢疾、阿米巴肠炎、溃疡性结肠炎、急性阑尾炎等疾病[2]和一些病毒感染性肠道疾病。随着畜禽养殖业的不断发展，与大肠湿热证相关的疾病日渐上升，给畜牧业经济效益带来严重损失。

大肠湿热证的发生会导致畜禽机体出现应激，破坏动物机体的动态平衡。下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴是应激反应的神经内分泌网络之一，也是最重要的环节(图1)。生理情况下，HPA轴的负反馈调节处于动态平衡状态。当机体受到强烈刺激时，HPA轴的动态平衡被扰乱，就会引起多种疾病的发生，如脾胃湿热证[3]、糖尿病[4]和中枢神经系统疾病如自闭症、抑郁症、帕金森和阿尔海默症等的发生均与HPA轴功能失调关系密切[5]。CRH(Corticotropin Releasing Hormone, CRH)是上游重要的神经激素和调节因子之一，被证明在HPA轴负反馈调节中起核心作用[6]。当机体遇到应激刺激时，会作用于神经系统的不同部位，最后将信息汇集于下丘脑CRH神经元，然后通过CRH引起垂体-肾上腺皮质系统反应。其最主要表现为HPA轴的强烈兴奋，PVN(Paraventricular nucleus, PVN)会大量分泌CRH，从而引起ACTH(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)和GC(Glucocorticoid，GC)分泌增多，最终导致其负反馈调节紊乱[7]。因此，过量的CRH形成会导致HPA轴功能亢进，同时影响下游激素的分泌[8]。在HPA轴中，CRHR1(Corticotropin-releasing factor receptor 1)和CRHR2(Corticotropin-releasing factor receptor 2)已经被证明可以与CRH结合并控制其表达量[9]。并且CRHR1可能直接参与HPA轴中肾上腺CORT(CROT, Corticosterone)释放的调节[10]。此外，GR和CBG在HPA轴反馈调节中也起着重要作用[11-12]。因此，及时有效地控制CRH的产生或相关受体的表达，对大肠湿热证引起的HPA轴功能亢进具有调控作用。

郁金散是中(兽)医治疗胃肠湿热病证的经典方剂之一，由大黄、郁金、黄连、黄柏、黄芩、白芍、栀子和诃子组成，临床实践表明，郁金散对大肠湿热证具有较好的治疗效果。而关于郁金散对大肠湿热证机体HPA轴调控的研究尚未见报道。本研究通过分子对接和网络分析，建立了郁金散治疗大肠湿热证的网络药理学研究，该研究基于郁金散的活性成分和5个潜在靶点，包括CRH、CRHR1、CRHR2、CBG和GR，并通过建立大肠湿热证大鼠模型，用郁金散来治疗以进行生物学验证，以揭示郁金散对大肠湿热证大鼠HPA轴调控的作用机制，为研发治疗大肠湿热证中兽药提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与菌种 7周龄清洁级Wistar大鼠60只，体重180～220 g，雌雄各半，购于兰州大学医学院实验动物中心，生产许可证号为：SCXK(甘)2013-0002。产毒性大肠杆菌O101，菌号CVCC231，由中国兽药监察所提供。

1.2 药物与主要试剂 大黄、郁金、黄芩、黄连、栀子、黄柏、白芍和诃子，购自甘肃西域阳光大药房，经甘肃农业大学中兽医学教研室鉴定。郁金散根据课题组前期实验建立的方法制备[13]。用HPLC法测定了郁金散中主要有效成分。

营养琼脂，批号20140807，青岛高科园海博生物技术有限公司；甲醛、无水乙醇、二甲苯，购于津致远化学试剂有限公司；苏木精、伊红，购于北京化工厂；促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)ELSA试剂盒，购于北京奇松生物技术有限公司。试剂均为国产分析纯，实验用水均为纯水。

1.3 主要仪器 DZ5-WS 多管架自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；iMark型酶标仪，美国BIO-RAD公司；KD-BM组织包埋机，上海艾牧生物科技有限公司；RM2245切片机，德国Leica公司；Olympus DP-71显微照相系统，日本Olympus公司。

1.4 靶标蛋白和配体结构的准备 从Protein Data Bank 数据库(http: ∥www. resb. org)中检索所有候选受体的晶体结构，包括CBG、CRH、CRHR1、CRHR2和GR作为HPA轴功能亢进的潜在靶点。从PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载郁金散相关活性成份的SDF格式的化学结构文件，保存为SDF格式，然后在ChemBio3D 模块用MM FF94力场对这些化合物的结构进行优化。然后将受体的三维结构导入PyMOL(https:∥pymol.en.softonic.com/download)中，删除靶蛋白分子结构中的水分子，并清除蛋白结构中相关配体。

1.5 分子对接与网络模型构建 将处理过的受体和郁金散活性成分分别导入AutoDock 4.2(http:∥mgltools.scripps.edu/downloads)进行半柔性对接模拟计算。对接时，用Autogrid程序自动生成打分用的格点文件(受体的格点盒子的大小以包括复合物中配体为标准)，运用拉马克遗传算法(LGA)，得到结合自由能，并将其与对接结果进行评价。然后根据分子对接计算结果，采用 cytoscape 3.6.1 软件构建郁金散调节HPA轴功能亢进的“有效成分-靶点”网络模型，通过将药物有效成分和靶点相连，绘制成一个宏观的互作网络，较为直观地确定药物有效成分作用的靶点。根据分子对接计算结果，把分子与受体导入Cytoscape 3.6.1网络分析软件，构建郁金散活性成分与靶点作用网络，预测郁金散的活性成分、潜在靶点等。

1.6 动物分组及造模 将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、自愈组和郁金散高、中、低剂量组，每组10只。正常对照组：自然环境下饲养，自由饮水并给予充足的普通饲料。按照实验室已建立的方法进行大肠湿热证模型复制[13-15]，郁金散各剂量治疗组和自愈组：自由饮用蜂蜜水和灌服猪油，共10 d；然后灌服白酒，置于高温高湿仓中，共5 d；再连续2天腹腔注射产毒性的大肠杆菌溶液，然后在自然环境中饲养一天；正常对照组灌服和腹腔内注射等量的生理盐水。造模结束后，模型组大鼠处死取样，正常对照组和自愈组给予生理盐水；其余三组分别给予等量不同浓度的郁金散进行治疗，连续灌服5 d，第6天处死剩余大鼠取样。

1.7 血清中CRH、ACTH、CORT检测 用酶联免疫(ELISA)法按试剂盒说明检测血清中CRH、ACTH、CORT的含量。

1.8 肾上腺指数测定 取出肾上腺，浸入生理盐水中洗净附着血液，用滤纸吸干表面的水分，迅速称重。其重量与体重量之比计算肾上腺指数(mg·g-1)。

1.9 肾上腺组织病理切片制作与观察 将肾上腺置于4%中性甲醛溶液中固定，流水冲洗24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色，然后用中性树胶封片。采用OlympusDP-71显微镜进行观察并拍照。

1.10 统计学分析 采用SPSS 23.0统计软件对所有实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，并以平均数±标准差(Mean±SD)表示，P<0.05被认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 郁金散活性成分测定 用HPLC法测定了郁金散中7种主要有效成分没食子酸、盐酸小檗碱、芍药苷、黄芩苷、栀子苷、姜黄素和大黄素的含量，分别为1.624、2.541、2.783、21.633、17.349、0.149和0.104 mg·g-1。

图2 郁金散活性成分化学结构式；A：黄芩苷；B：盐酸小檗碱；C：姜黄素；D：大黄素；E：没食子酸；F：栀子苷；G：芍药苷

2.2 分子对接与“药效分子-靶标”网络构建分析从对接数据和网络分析上看，郁金散中既存在一个分子与多个靶点相互作用，同时也存在不同分子作用于同一个靶点的现象，显示了郁金散的多成分多靶点作用特点。GR和CRH与郁金散活性成分对接实验的结合自由能较其他几种受体和配体对接的数据小，说明GR和CRH与郁金散活性成分受体结合能力较强，其他结合作用相对较弱；其中GR与大黄素的结合自由能最低，说明GR与大黄素结合能力最强。并且CRH与黄芩苷、盐酸小檗碱、姜黄素等5种成分存在相互作用。CBG、CRHR1和CRHR2与盐酸小檗碱有较强的相互作用；CRH、CRHR2和GR等与没食子酸、大黄素有较强的相互作用，所以可以推测CRH可能是调控HPA轴亢进的潜在靶点，盐酸小檗碱、没食子酸、大黄素可能是郁金散调节HPA轴亢进的活性成分。此外，栀子苷和芍药苷与这几种受体均无形成有效对接，故其对HPA轴的调控作用可能较弱或无作用。

表1 郁金散活性成分与HPA轴相关受体对接数据

2.4 CRH及下游激素的验证分析

2.4.1 肾上腺指数测定 如图所示，与正常对照组相比，模型组大鼠肾上腺指数极显著性升高(P<0.01)，自愈组大鼠肾上腺指数显著性升高(P<0.05)。郁金散各剂量治疗组与自愈组相比，高剂量组中肾上腺指数显著性降低(P<0.05)，中、低剂量组中肾上腺指数有降低趋势(P>0.05)。结果表明：大肠湿热证模型组大鼠肾上腺指数明显升高，各剂量郁金散均能降低大鼠的肾上腺指数，且高剂量组效果最好。

2.4.2 血清中CRH、ACTH、CORT含量的变化 如图所示，与正常对照组相比，模型组和自愈组中CRH、ACTH、CORT含量极显著性升高(P<0.01)。郁金散各剂量治疗组与自愈组相比，高、中剂量组中CRH、ACTH含量均极显著降低(P<0.01)，低剂量组中CRH、ACTH含量也显著性降低(P<0.05)；而高剂量组中CORT含量均极显著降低(P<0.01)，中剂量组中CORT含量也显著降低(P<0.05)。结果表明：大肠湿热证模型大鼠血清中CRH、ACTH、CORT的含量明显升高，各剂量郁金散均能降低模型大鼠血清中三者含量，且高剂量组效果最好。

图3 郁金散活性成分与HPA轴相关受体对接结果的三维示意图

图4 郁金散活性有效成分与靶点相互作用的网络

注：“*”表示差异显著(P<0.05)；“**”表示差异极显著(P<0.01)，以下同此。

图6 郁金散对大肠湿热证大鼠血清中CRH、ACTH和CORT的影响(Mean±SD，n=10，pg·mL-1)

2.4.3 肾上腺组织病理学观察 肾上腺组织病理学观察结果显示，正常对照组球状带细胞为卵圆形或柱状，核为球形，染色深，含1～2个核仁，核/质比例大，胞质中含一些散在的嗜碱性物质。束状带细胞较球状带细胞大，呈多边形，可见有双核，核圆形，胞质可呈嗜酸性，也含有嗜碱性物质，胞质内可见较丰富脂滴。网状带细胞排列成不规则的吻合索，索间窦清晰。网状带细胞有明细胞和暗细胞之分。明细胞较大，核也大，染色淡。暗细胞较小，胞质和胞核着色均较深。与对照组相比，模型组球状带中毛细血管扩张，含有较多红细胞，球状带细胞自身变化不明显；束状带细胞脂滴含量有所增多。网状带细胞出现较大面积的空泡化，并且网状隙内的血窦中红细胞较多，显示存在瘀血现象；经高剂量郁金散治疗后，各项指标均显示有所恢复(图7)。

图7 肾上腺组织切片观察(HE染色)

3 讨论与结论

成分-靶标的网络分析表明，郁金散中有效成分没食子酸、小檗碱和大黄素等能有效改善HPA轴亢进，并且CRH作为HPA轴上游激素在整个网络中处于重要地位，直接影响下游激素的分泌。通过动物实验对CRH及其下游激素进行验证结果表明，大肠湿热证模型组和自愈组血清中CRH、ACTH、CORT的含量及肾上腺指数均显著性升高，张鑫、武凯歌等[16-17]等研究表明脾胃湿热证大鼠血浆中CRH、ACTH，血清中的COR含量及肾上腺指数显著升高，朱星[3]等研究表明脾胃湿热证大鼠血浆中CRH、ACTH的含量显著升高；这些研究结果均与本研究结果相符。肾上腺组织病理学结果显示，与正常对照组相比，模型组束状带和网状带结构不清，细胞排列不规则，细胞质呈空泡状，脂滴增多，经郁金散治疗后，均有所恢复。肾上腺皮质中束状带分泌糖皮质激素，肾上腺皮质束状带细胞损伤会导致糖皮质激素分泌的减少，进而使下丘脑和垂体前叶对CRH和ACTH的分泌增加，致使HPA轴功能亢进。CRH在应激反应中发挥重要作用，并通过促肾上腺皮质激素释放激素受体(CRH-Rs)功能的改变引起一系列的生理和病理变化[18]，主要是促进垂体前叶分泌和合成ACTH，CRH的分泌增多导致血清中ACTH升高[19]；ACTH是维持肾上腺正常形态和功能的重要激素[20]，一旦肾上腺功能活动增强，便会出现质量增加及组织肥大，导致肾上腺指数升高。

现代药理学研究表明：没食子酸作为一种有机酸，是郁金散成分中含量最高的。它可以降低不可预知的慢性轻度应激引起的皮质酮CORT含量升高，改善慢性应激引起的HPA轴紊乱[21]。小檗碱作为黄连和黄柏的主要有效成分，对2型糖尿病大鼠引起的HPA轴功能亢进功能具有调节作用，主要表现在CORT和ACTH含量降低[22]。也有证据证明，小檗碱可以减少皮质酮诱导的抑郁模型小鼠血清中CORT的表达[23]。姜黄素作为方中郁金的主要成分，它可以显著降低慢性应激模型大鼠血清中糖皮质激素的水平，恢复海马对HPA轴的抑制作用[24]。黄芩苷作为黄芩中主要的活性黄酮成分，据报道，它在HPA轴功能异常导致的抑郁症中起着重要作用，黄芩苷可以减轻嗅球切除(OBX)抑郁或皮质酮诱导的抑郁模型大鼠血清皮质酮水平，改善HPA轴功能障碍[25,26]。近期的一项研究发现，黄芩苷主要通过参与GR信号通路来减少慢性皮质酮引起的GR磷酸化，使下丘脑GR核易位正常化，恢复HPA轴正常功能，减轻小鼠异常行为[27]。而大黄素作为大黄的主要成分，亦是郁金散方中含量最少的，参与了HPA轴的神经内分泌调节[28]。也有证据表明，栀子苷和芍药苷可以改善由于HPA轴亢进造成CORT、CRH含量升高和肾上腺指数增[29,30]，但构建的网络中没有显示这种相互作用，可能栀子苷和芍药苷是通过间接方式来调节HPA轴功能亢进，其机理需要进一步研究。研究表明传统中兽药复方郁金散能够较好地调节大肠湿热证大鼠HPA轴功能，降低CRH、ACTH、CORT的表达，抑制大肠湿热证模型大鼠肾上腺肥大而抗应激。此外，郁金散中一些其他未被发现和测定的成分，也有可能起到调节HPA轴失衡的功效。

分子对接与网络分析推测CRH可能是调控HPA轴亢进的潜在蛋白，盐酸小檗碱、没食子酸、大黄素可能是郁金散调节HPA轴亢进的活性成分。大肠湿热证可引起机体HPA轴功能亢进，主要表现为血清中CRH、ACTH及CORT的含量升高，肾上腺指数增加，以及肾上腺皮质球状带、束状带和网状带细胞的损伤。经郁金散治疗后，指标得到恢复。说明传统中药复方郁金散对大肠湿热证模型大鼠HPA轴的动态平衡具有较好的调节作用，为研究大肠湿热证的发病机制及郁金散对大肠湿热证的治疗机制提供了依据。