柴银口服液醇沉工艺对黄芩苷收率的影响△

张微，关永霞，韩振明，冯倩，马健，杜昊忱*，张贵民

1.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006；2.中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；3.鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276006

柴银制剂是治疗风热感冒的三类中成药，具有清热解表、宣肺泄热、化痰利咽止咳的功效，用于治疗风热之邪侵袭而致邪袭肺卫之发热恶寒、头痛咳嗽、咽红肿痛、舌边尖红、脉浮数之风热表实证[1]。柴银制剂具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态、解痉及清除氧自由基作用，其中有显著的生物活性的黄芩苷为柴银制剂的主要指标成分。现阶段，单独提取黄芩药材中的黄芩苷时，主要采用水提酸沉法[2]、碱提酸沉法或乙醇直接提取法[3-4]。通过检索，黄芩苷提取是国内外医药保健领域的研究热点，但关于黄芩制剂合并提取、醇沉工艺的研究相对较少，主要原因为黄芩苷在冷水和醇中的溶解度低，导致黄芩相关制剂的醇沉过程会损失较大比例的黄芩苷，柴银制剂的醇沉过程亦存在同样问题。黄芩苷转移率低是柴银制剂质量提升的限制因素，柴银制剂水提液含有糊化淀粉、脂溶性色素、油脂等，为保证中成药的安全性、稳定性和有效性，需要对提取液精制纯化。

现代中药生产常用的精制方法是醇沉除杂[5]，有关醇沉工艺及醇沉机制的报道较少[6]。醇沉工艺是一个除杂取精的过程，考虑所选溶剂含醇量、加醇方式、醇沉温度、终点乙醇含量等多方面因素，目的是降低杂质在醇溶液中溶解度的同时有效成分溶解度可控而进行除杂取精。研究初期可以选用单因素试验考察[7]，但无法综合反映各因素之间的交互作用，而正交试验是评价多因素共同作用的一个常规评价方法[8-10]，但正交试验只反映醇沉工艺中“取精”的一面，无法反映 “除杂”在醇沉工艺的结果。

本研究将“取精”与“除杂”两方面相结合。因中药成分复杂、治疗机制复杂，不可一味追求除杂，降低干物质量，要在两者中找到一个平衡点来使其对立统一。本研究以黄芩苷的含量和醇沉上清液干物质量作为指标综合评价，确定柴银口服液最佳醇沉工艺。通过比较研究发现，醇沉一段时间内，黄芩苷保留率逐渐升高，达到最佳时间后黄芩苷的保留率反而下降，且醇沉时间对上清液所含干物质量影响不大。前期试验发现，碱化乙醇2步醇沉后得到的黄芩苷含量高于简单1步醇沉，因此，本研究将2步醇沉作为突破点，对其工艺条件进行探讨。从大生产的安全性和实用性考虑，2步醇沉中预醇沉所用低浓度的碱化乙醇体积为清膏体积的2倍，醇沉时间选用最佳黄芩苷保留时间，易于实现大规模应用。因此，本研究采用正交试验的方法对柴银口服液提取的清膏进行醇沉工艺条件的优化，并结合醇沉上清液的干物质作为评价指标，利用高效液相色谱法(HPLC)测定黄芩苷含量，筛选最优醇沉工艺。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；R2002型旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司)；SHB-B95型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；XS204型电子分析天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 试药

柴银口服液提取清膏(鲁南厚普实验室制备，密度为1.12)；高效液相用试剂均为色谱纯；分析用试剂均为分析纯；黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110715-201821,CAS：21967-41-9，纯度≥98%)。

2 方法

2.1 黄芩苷含量测定

黄芩苷含量测定方法参考《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版一部柴银口服液项下HPLC测定黄芩苷含量的方法，柴银口服液提取清膏液相色谱图及黄芩苷对照图谱见图1，计算醇沉上清液黄芩苷含量，并按公式(1)计算黄芩苷转移率(α)。

α=(醇沉上清液黄芩苷含量/柴银口服液提取清膏黄芩苷含量)×100%

(1)

注：A.供试品溶液；B.对照品溶液。

2.2 干物质得率测定方法

干物质得率测定方法参考《中国药典》2015年版四部通则0831“干燥失重测定法”，精密量取醇沉上清液10 mL，称量，记录上清液质量，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱，干燥至恒重，干燥器中冷却至室温，称质量，按公式(2)计算干物质得率(δ)。

δ=(干物质质量/上清液质量)×100%

(2)

2.3 醇沉时间考察

称取5份柴银口服液提取清膏，每份35 g，分别以10 mL·min-1匀速加入pH=7、60%乙醇62.5 mL，再以10 mL·min-1匀速加入95%乙醇，使药液终点乙醇体积分数为60%，于2～4 ℃温度下静置，分别于12、16、20、24、30、36 h取样，并量取上清液体积，测定黄芩苷含量并计算黄芩苷转移率，计算干物质得率。

2.4 醇沉工艺正交试验设计

取柴银口服液提取清膏，根据醇沉的影响因素及有效成分的性质，对预醇沉所用碱化乙醇的pH(A)、碱化乙醇含醇量(B)及二次醇沉所用高浓度乙醇的含醇量(C)进行考察。为使醇沉工艺更趋合理，本研究采用了L9(34)正交表进行正交试验，开展醇沉工艺优化。根据表1，取柴银口服液提取清膏，每份含有黄芩苷5 g，共计9份，按设计方案进行醇沉。醇沉后搅匀，冷藏24 h，滤过，得醇沉上清液。以黄芩苷为考察指标，测定醇沉上清液中黄芩苷的含量。

表1 柴银口服液提取清膏醇沉试验正交因素水平

2.5 最佳醇沉工艺验证实验

按批次量扩大20倍称取柴银口服液提取清膏，共计3份，加入清膏体积2倍量的pH为8、含醇量为60%的碱化乙醇进行预醇沉，搅拌均匀后，再加入含醇量为85%的乙醇进行二次醇沉至醇沉液含醇量达60%，醇沉后搅匀，冷藏24 h，滤过，得醇沉上清液。

3 结果与分析

3.1 不同醇沉时间考察结果

不同醇沉时间对黄芩苷转移率、干物质得率的影响结果见图2。

注：A.黄芩苷转移率；B.干物质得率。

由图2A可知，在一定范围内，随着醇沉时间的延长，黄芩苷保留率逐渐升高。当时间超过24 h时，黄芩苷保留率反而开始下降，这是由于随时间延长沉淀越来越板结，容易把黄芩苷包裹夹带其中不容易释放出来，再者随时间延长，分子之间的范德华力也会使一部分黄芩苷沉降下来而造成的损失。图2B则表明，醇沉时间对干物质得率影响不大，杂质在乙醇溶液中的析出在12 h内已达到平衡，再延长醇沉时间对杂质去除变化不大。综上，确定最佳醇沉时间为24 h。

3.2 正交试验结果与分析

3.2.1正交试验测定结果 9组正交试验指标测定结果中的黄芩苷含量、干物质得率与黄芩苷转移率见图3。

注：A.黄芩苷含量；B.干物质得率；C.黄芩苷转移率。

3.2.2正交试验测定结果方差分析、主效应分析与直观分析 对黄芩苷转移率进行方差分析，分析结果见表2。经方差分析可以看出，各正交试验组之间黄岑苷保留率差异无统计学意义。

将黄芩苷转移率进行主效应分析，见图4。

表2 正交试验醇沉上清液黄芩苷含量方差分析

图4 9组正交试验黄芩苷转移率主效应图

正交试验醇沉上清液黄芩苷含量测定结果直观分析见表3。由表3可知，碱化乙醇pH为8的高于pH为7和9的对醇沉黄芩苷损失影响；预醇沉碱化乙醇50%含醇量与60%含醇量比较，醇沉黄芩苷损失相差不大，预醇沉碱化乙醇含醇量60%略高于碱化乙醇含醇量50%和70%，二次醇沉含醇量85%略高于二次醇沉含醇量70%，且高于二次醇沉含醇量95%，碱化乙醇pH和碱化乙醇含醇量对黄芩苷影响差异无统计学意义，但二次醇沉含醇量对降低醇沉工艺黄芩苷的损失差异有统计学意义(P<0.05)，但A2B2C2均略高于预醇沉碱化乙醇含醇量50%和二次醇沉含醇量为70%的乙醇。因此，从实际生产考虑，醇沉工艺及之后乙醇回收过程中的时间、能耗成本和资源节约、操作方便性的角度考虑，及由正交试验直观分析和方差分析结果可以确定最佳醇沉工艺为A2B2C2，即预醇沉碱化乙醇pH为8，碱化乙醇含醇量为60%，二次醇沉乙醇含醇量85%。

表3 正交试验醇沉上清液黄芩苷含量直观分析

3.3 最佳醇沉工艺验证实验结果

对上述优化后的醇沉工艺进行3批验证实验，3次醇沉上清液平均体积为77.05 L，平均黄芩苷转移率为90.08%，结果与小试工艺优选结果差异无统计学意义。通过3次平行验证实验，醇沉上清液体积和总黄芩苷含量的结果，其RSD均小于3%，表明工艺稳定、合理。

4 结语

本实验以柴银口服液提取清膏为原料，研究了柴银口服液醇沉工艺对黄芩苷转移率的影响；在实际的生产过程中，醇沉工艺采用加入浸膏体积2倍量的预醇沉碱化乙醇pH为8、碱化乙醇含醇量为60%、二次醇沉乙醇含醇量85%，醇沉后上清液中黄芩苷转移率最高为90.08%。该方法增加黄芩苷在醇溶液中溶解度，减少由于夹带沉淀造成损失，依据相关物质的得失均衡，醇沉上清液中黄芩苷的含量体现有效成分的保留，醇沉上清液的干物质质量反映杂质的去除，从而达到醇沉工艺去除杂质而提高药品疗效的目的，因此，小试的最佳醇沉工艺可为中试和大生产工艺提供有利的数据支持。

该研究为柴银制剂工业醇沉工艺提供实验基础，同时对于其他含有黄芩苷中成药的醇沉工艺优化也有借鉴作用。该醇沉工艺试验结果表明，工艺稳定，重复性好，可降低醇沉工艺对黄芩苷的损失，保证柴银制剂大生产的产品中黄芩苷含量及临床疗效，为含有黄芩苷且有醇沉工艺的中成药品种生产提供参考。