鄂北岗地山药病害病原菌鉴定

杨小林，张佑宏，王佐乾，常向前，吕 亮，张 舒，杨新笋

（1. 粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064；2. 湖北省农业科学院植保土肥研究所，湖北 武汉 430064；3. 湖北省生物农药工程研究中心，湖北 武汉 430064；4. 湖北省农业科学院粮食作物研究所，湖北 武汉 430064）

0 引言

【研究意义】 山药（Dioscorea batatas Decne），又名大薯、薯蓣，是一种药食两用的深根性草质藤本植物[1]，是薯类的一个重要类别。由于山药具有较高的药用价值和营养价值[2−3]，鄂北岗地一直有种植山药的栽培传统，随着农村产业结构的调整和山药种植面积的逐年扩大，山药已成为当地农村经济的主导产业。山药栽培过程中为害地上叶片和茎蔓造成枯叶枯枝的重要病害有炭疽病[4]、褐斑病等，常年因病害减产20%左右，严重年份达到80%，给山药产业造成了极大的损失。由于对山药主要病害的病原菌欠缺分离和鉴定，致使病害的病原菌不清，因此开展对山药病害病原菌的分离和鉴定是当务之急。【前人研究进展】 对造成作物炭疽病害的炭疽菌（刺盘孢属，Colletotrichum）的研究，从最初报道发现至今已有很长的历史，炭疽菌已成为世界第八重要植物病原真菌[4]。基于形态学特征和分子生物学技术，多国学者在其分类方面取得了显著的进展[5−6]。王国平团队[7]通过对我国梨品种中的白梨、砂梨和西洋梨炭疽病样品的研究，表明果生炭疽菌C. fructicola是我国梨树炭疽病的优势流行菌种，研究还发现两个刺盘孢属新种C. jinshuiense和C. pyrifoliae。山药炭疽病是引起山药地上叶片和藤蔓组织发病的重要病害，国内外关于山药病原菌的研究表明，山药炭疽病原菌属于子囊菌亚门胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz）[8−11]、Gloeosporium Pestis[12]或者辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）[13]。Dean 的研究结果表明，山药炭疽病病原菌在地理分布上存在差异[10]。 【本研究切入点】 鄂北岗地山药病害严重且病原菌不清，有关鄂北岗地山药病害病原菌的研究未见报道。【拟解决的关键问题】明确鄂北岗地山药病害病原菌的分类地位，科学认识鄂北岗地山药病害的病原特性，通过与其他作物上同类病原菌的分类进行比较，从而有效指导科学用地，避免病害相互侵染。

1 材料与方法

1.1 病样采集和病原菌的获得

1.1.1 鄂北岗地山药病害病样采集 2019 年8 月于鄂北谷城县调研山药生产情况，发现山药病叶，装袋保存并记录，带回实验室保存备用。

1.1.2 病原菌的分离和纯化 采用组织分离法[14]对叶片病样进行病原物的分离与纯化。

1.2 致病性测定

准备接种用的5 mm 菌饼若干。在9 cm 培养皿底部垫上用无菌水浸湿的纸巾，将新鲜健康山药叶片平铺于培养皿中保湿，采用人工离体接种方法进行致病性测定，接种方法包括有伤、无伤两种处理方式[15]。

1.3 病原菌的形态特征观察

1.3.1 病原菌PDA 菌落观察 于PDA 平板上25 ℃、12 h /12 h 光暗交替下培养病原菌7 d，观察菌落的形态特征；用0.05%吐温20 溶液洗下病原菌孢子，制作玻片在OLYMPUS 1X2-UCB 显微镜下观察病原菌的形态。

1.3.2 病原菌侵入组织观察 以山药叶片主叶脉为中心，对称切取2 块1 cm2接种后的山药叶片，参照文献[16]的方法进行染色并保存备用；制作简易玻片[14]，于显微镜下观测病原菌的形态特征并拍照。

1.4 病原菌的分子鉴定

采用CTAB 方法[17]提取病原物基因组DNA，进行ITS-PCR 鉴定[18]，通过PCR 产物测序获得病原真菌ITS 序列，与GenBank 中的序列进行BLAST 比对分析。引物合成和PCR 扩增产物测序分别由上海生工生物工程技术服务有限公司和武汉天一辉远公司完成。

2 结果与分析

2.1 病原物的形态特征

于鄂北岗地谷城县春天山药种植专业合作社田间采得山药感病叶片，上面清晰可见褐色不规则形状病斑（图1）。于实验室分离获得真菌分离物，经纯化后获得4 个代表菌株，分别标记为C20FG001～C20FG004（图2）。在PDA 培养基上，C20FG001 菌落灰色，气生菌丝发达，表面蓬松，边缘整齐。该菌在常规培养基上不产生子实体，后在人工接种24 h的山药叶片上发现有分生孢子，孢子大小约13.77 μm×4.22 μm，呈长筒形，内有核，分成双孢（图3-A）。C20FG002 菌落灰白色，短绒状，紧凑，圆形，边缘较整齐。菌丝光滑有隔膜，分生孢子大小约20.15 μm×9.83 μm，倒棒状或纺锤形，顶端有喙状突出，成熟的分生孢子内有2 至多个分隔，分生孢子可数个成链（图3-B）。C20FG003 菌落色深，近黑色，短绒状，色均，圆形，边缘整齐。营养菌丝光滑有隔，分生孢子大小约14.92 μm×4.27 μm，两端钝圆，有的中间略有内陷，棍棒形或圆柱状，内部中间色浅两端色深，显示有物质均匀分布（图3-C）。C20FG004菌落深灰色，紧凑，色均，平展，边缘整齐。营养菌丝有隔，分生孢子大小约13.11 μm×4.40 μm，两端钝圆，多数呈短圆柱状，少数为纺锤形，孢子内中间色浅两端色深有物质均匀分布（图3-D）。

2.2 病原菌的ITS 鉴定

为进一步明确病菌的分类地位，对菌株进行DNA-ITS 鉴定（图4）。4 段序列的大小介于510～550 bp。比对Genbank 中已登录的模式序列，发现代表菌株C20FG001 与假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae，登录号为KY783459.1）的同源相似性达100%， C20FG002 与互隔交链孢霉（Alternaria alternata，登录号为KX064978.1）的同源相似性达99.63%， C20FG003 与果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola，登录号为KP748224.1）的同源相似性达99.27%， C20FG004 与胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides，登录号为MK967281.1）的同源相似性达96.37%。根据菌落的培养形态、分生孢子的显微形态及ITS 序列的比对分析，确定鄂北岗地山药病害的病原菌包括：座囊菌纲（Dothideomycetes）葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）毛色二孢属（Lasiodiplodia）的假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）、座囊菌纲（Dothideomycetes）格孢腔菌目（Pleosporales）格孢菌科（Pleosporinea）链格孢属（Alternaria）的互隔交链孢霉（Alternaria alternata），以及粪壳菌纲（Sordariomycetes）小丛壳目（Glomerellales）小丛壳科（Glomerellaceae）刺盘孢属（Colletotrichum）的果生炭疽菌（C. fructicola）和胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

图 1 山药病叶Fig. 1 Diseased leaves on vines of Chinese yam

图 2 菌落形态Fig. 2 Colony morphology

图 3 显微形态Fig. 3 Microstructure

图 4 菌株基因组DNA-ITSFig. 4 Applied fragment of pathogenic fungi by DNA-ITS

2.3 病原菌的致病性测定

无伤情况下分别接种4 个菌株，山药叶片上均未出现病斑；有伤情况下（图5），接种4 个菌株的菌饼，C20FG001 经ITS 鉴定为假可可毛色二孢，接种后叶片于96 h 出现明显病斑，接种处叶片组织变深褐色，水渍腐烂状。C20FG002 经鉴定为互隔交链孢霉，接种处叶片组织于24 h 感病，病斑边缘深褐色，中央灰白色，周围有水浸状晕圈。C20FG003 和C20FG004 系炭疽菌，接种后山药叶片组织于48 h 后出现明显病斑，96 h 后病斑上出现橘色胶质颗粒，表现明显的炭疽病病状和病症。有伤、无伤空白对照无变化。对人工接种24 h 后的山药叶片进行染色、脱色处理，显微镜检显示接种C20FG002、C20FG003和C20FG004 的叶片出现大量分生孢子，孢子外形同图3；C20FG001 在培养基上没有检测到子实体，接种24 h 后通过染色、镜检发现叶片上出现成片的分生孢子（图3-A）。分别回收病样并作病菌分离和纯化，获得菌株的培养性状与接种菌株一致，因此确定 代 表 菌 株C20FG001、C20FG002、C20FG003 和C20FG004 是引起谷城县春天山药合作社基地山药叶片及茎蔓发生枯萎和死亡的病原真菌。

图 5 山药叶片接种菌株后的发病情况Fig. 5 Symptoms on leaves of Chinese yam plants after artificial fungal inoculation

3 讨论与结论

本研究在山药感病叶片上分离获得11 个菌株，经培养、显微观察、ITS 鉴定及序列比对，选择出代表菌株4 株，分别为假可可毛色二孢Lasiodiplodia pseudotheobromae、互隔交链孢霉Alternaria alternata、果生炭疽菌Colletotrichum fructicola、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。经致病性测定，确定这4 个代表菌株均是引起山药健康叶片感病的致病病原菌。

假可可毛色二孢是农、林业的重要植物致病菌，其寄主范围广泛，可侵染寄主植物的枝干和果实，王佳宁等[19]报道假可可毛色二孢是引起山东青岛胶南蓝莓枝枯病的致病真菌，该研究也是对假可可毛色二孢侵染蓝莓的首次报道。本研究从鄂北岗地山药枯死的病组织中分离、鉴定出假可可毛色二孢，在以往的国内外研究中均未见报道假可可毛色二孢可侵染山药。

链格孢是农作物上的重要致病菌，至今已报道的有500 多种，能引起寄主作物落花落果和枯梢等，造成的病害包括重要经济作物，如柑橘链格孢褐斑病（Alternaria brown spot, ABS）[20−21]、新疆红枣缩果病和枣果黑斑病[22]，可导致严重的经济损失。本研究分离获得的互隔交链孢霉，会造成山药叶片和茎蔓出现病斑甚至枯死，是否会引起山药块茎产生病害，还需进一步的研究。

本研究中分离获得的胶孢炭疽菌是狭义的胶孢炭疽菌C. gloeosporioides和分离获得的果生炭疽菌C. fructicola同属广义的胶孢炭疽病复合群C.gloeosporioides，该群最初包括13 个合格种、10 个新种、1 个变种[23]，之后不断有新种添加进胶孢炭疽菌复合群中[24]。依据形态学特征和ITS 序列鉴定出的炭疽病菌属于刺盘孢属Colletotrichum中的重要分支——胶孢炭疽病复合群C. gloeosporioides，表明鄂北岗地山药炭疽病系由复合群内多个分类单位的真菌引起的，其精细分类地位尚需在后续研究中进行多基因与ApMat 系统发育分析。已报道的鄂西地区山药炭疽病病原为胶孢刺盘孢（C.gloeosporiodes）[4]，其与本研究鉴定出的胶孢刺盘孢（C.gloeosporiodes）是否属于同一种下分类单位，还需作进一步的采样与鉴定研究。

刺盘孢（Colletotrichum）中重要的分支菌群胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）不仅能侵染山药，而且能够侵染茶叶[25]、茶源植物多穗柯[26]、辣椒[27]、大豆[28]、草莓[29]、菠萝蜜[30]等，严重影响作物的健康生长，降低其产量和品质。王薇[31]通过对苹果炭疽叶枯病的研究，鉴定出其病原菌为胶孢刺盘孢复合群下的3 个种：果生刺盘孢C. fructicola、隐秘刺盘孢C. aenigma和嘎拉刺盘孢C. galae，同时对苹果园周边的辣椒、猕猴桃、葡萄等寄主作物的炭疽病标样进行分析测定，研究结果表明：来自苹果园周边寄主的炭疽菌可以作为苹果炭疽病的侵染源。鄂北岗地山药生产基地炭疽病菌的来源及周边农作物是否相互感病尚待进一步深入研究。

本研究在形态学鉴定的基础上，结合现代分子生物学方法对病害的病原菌进行了系统鉴定和分析，结果显示：鄂北岗地大田山药的生长环境复杂，有多病害发生，厘清病原菌的组成及分类地位，对于病害的预防和防治，尤其是对于通过绿色防控措施降低大田环境中的重要病害菌源、减少重要病害造成的经济损失，以及保障山药产业的健康发展均具有积极意义。

致谢：感谢湖北省农业科学院薛敏峰博士在测序结果分析中给予的热心帮助！