利用BSA-Seq 方法鉴定谷丰B 抗稻瘟病基因

陈子强，陈松彪，郭新睿，颜静宛，田大刚，李 刚，王 锋

（1. 福建省农业遗传工程重点实验室/福建省农业科学院生物技术研究所，福建 福州 350003；2. 闽江学院海洋研究所海洋与农业生物技术实验室，福建 福州 350108）

0 引言

【研究意义】稻瘟病是水稻最主要病害之一，每年可造成水稻10%～30%减产，严重年份部分稻区甚至出现绝收[1−2]。因此，稻瘟病防治一直是水稻生产和育种的重中之重。长期实践证明，培育和种植抗病水稻品种是防治稻瘟病最经济、安全和有效的措施，而发掘和鉴定稻瘟病抗性基因对于开展水稻抗病育种具有重要意义。【前人研究进展】截至目前，全世界已鉴定了100 多个稻瘟病抗性基因，至少24 个基因被克隆，包括Pib、Pi-ta、Pi9、Pi2、Piz-t、Pigm、Pid2、Pi37、Pi36、Pik-m、Pi5、Pit、Pid3、Pid3-A4、Pi54、Pish、Pik-p、Pia、Pik、Pi-CO39、Pi25、Pi1、pi21 和Pb1 等[3−4]，促进了水稻抗稻瘟病分子育种的发展。然而，一方面抗性基因表现出对稻瘟菌生理小种高度专化性，另一方面由于稻瘟菌生理小种存在易变性，抗性基因在利用数年后抗性容易丧失，因此寻找和鉴定更多新的抗性基因一直被植物病理工作者和水稻育种家重视。近年来，兴起一种快速简单的性状定位的方法——混合群体分离分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA），其基于临时（如F1、F2 分离群体）或永久群体（如重组自交系、近等基因系）表现出明显差异的个体，通过构建DNA 混池进行基因定位。BSA 已被应用于水稻质量性状基因[5]和数量性状基因（QTL）[6−7]的定位。【本研究切入点】谷丰B 是福建省农业科学院水稻研究所选育的具有广谱、持久抗稻瘟病的优良品种，种植20 多年仍表现出稳定抗性[8]。该材料为挖掘广谱持久抗性基因及研究抗性分子机制带来了契机。【拟解决的关键问题】本研究以谷丰B 和日本晴分别作为稻瘟病抗病和感病亲本，配制F2 代遗传群体，接种稻瘟菌并鉴定表型。依据水稻稻瘟病抗性评价分级标准，选出极端材料构建感、抗池。通过BSA 测序分析，初步确定谷丰B 抗性基因连锁区间。本研究旨在为谷丰B 抗性基因精细定位及基因克隆奠定基础，并为分子标记辅助选择提供标记资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻材料谷丰B、福恢838、甬优1 号、圭630、福恢718、IR0462 和日本晴均由福建省农业科学院生物技术研究所提供。以抗病品种谷丰B 为母本和感病品种日本晴为父本，杂交获得F1 和F2 遗传群体。

稻瘟菌株501-3、KJ201、IR16-1、RB22、RB6、2Y838-1 和CHNOS 由福建省农业科学院生物技术研究所保存。

1.2 稻瘟病接种鉴定

稻瘟菌接种在燕麦（或米糠）培养基中，25 ℃暗培养5～7 d，随后刮掉表面菌丝并转移至25 ℃光照条件下培养3 d 诱导孢子产生，供接种用。

接种试验在福建省农业科学院生物技术研究所寿山实验基地进行，接种方法参考Tian 等[3]的方法。水稻幼苗生长至3～4 叶龄时，进行人工喷雾接种。接种后接种池覆盖遮光膜密闭24 h，揭开遮光膜后保证棚内相对湿度90%以上，温度24～28 ℃，5～7 d 后调查发病情况。

按照国际水稻研究所发布的稻瘟病分级标准进行病级统计[9]，即：高抗——无病斑；抗——有针尖大小棕色斑点；中抗——有圆形至椭圆形灰色斑，褐色边缘，直径约1～2 mm；中感——有典型纺锤状病斑，病斑面积小于叶面积的10%；感病——有典型纺锤状病斑，病斑面积占叶面积的10.1%～50%；高感——有典型纺锤状病斑，病斑面积大于叶面积的50%，甚至全叶枯死。

1.3 谷丰B 抗病性遗传分析

谷丰B 和日本晴的F1 和F2 群体接种501-3 和IR16-1 菌株，并统计F2 群体抗病和感病植株分离比，采用χ2测验进行分离比适合度检测。

1.4 极端分离混合池重测序

谷丰B 与日本晴F2 群体接种501-3 菌株后，挑选极端抗病单株和极端感病单株各20 株，同时取亲本谷丰B 和日本晴各10 株，采用CTAB 方法提取基因组DNA。分别将各自单株DNA 等量混合，利用二代测序技术对2 个混合池和两亲本进行20×和10×覆盖度的全基因组测序，测序和数据处理由诺禾致源公司（中国）完成。

参考Liang 等[10]的方法计算2 个分离池的SNP频率（SNP-index），随后对2 个子代SNP-index 作差（△SNP-index）。对△SNP-index 在各个染色体上的分布进行作图，选取95%置信水平作为筛选的阈值，确定连锁区间。

2 结果与分析

2.1 谷丰B 抗病性鉴定

利用7 个稻瘟菌株501-3、KJ201、IR16-1、RB22、RB6、2Y838-1 和CHNOS 对谷丰B、福恢838、甬优1 号、圭630、福恢718、IR0462 及日本晴等材料进行人工接种。图1 和表1 结果显示，谷丰B 对7 个供试菌株均表现高抗性，福恢838、甬优1 号、圭630、福恢718 和IR0462 水稻材料对501-3、IR16-1、RB6 和2Y838-1 菌株表现出不同程度的感病。上述结果初步表明，谷丰B 基因组中可能携带了广谱高抗稻瘟病基因。

图 1 不同水稻品种接种501-3 菌株表型鉴定Fig. 1 Phenotypic identification on rice varieties inoculated with 501-3 blast strain

表 1 水稻品种稻瘟病抗性鉴定Table 1 Blast resistance of rice cultivars

2.2 谷丰B 对稻瘟菌501-3 和IR16-1 的遗传分析

利用501-3 和IR16-1 菌株对谷丰B 和日本晴的F1和F2 群体进行接种，分析谷丰B 的抗性遗传模式。结果显示，F1 群体对501-3 和IR16-1 菌株均表现高抗，F2 植株出现不同程度抗病和感病。将抗病（包括中抗、抗和高抗）和感病（包括中感、感病和高感）植株的分离比按3:1 理论比例进行卡方测验，其对应501-3 和IR16-1 的χ2值分别为33.09 和27.98，均显著大于χ（0.05）2=3.84（表2），推测谷丰B 基因组存在多个位点影响稻瘟病抗性。

表 2 谷丰B 稻瘟病抗性遗传分析Table 2 Genetic analysis on blast resistance of Gufeng B

2.3 BSA 测序和数据分析

基于上述结果，采用BSA 方法对20 个高感单株和20 个高抗单株构建的DNA 混合池以及亲本进行全基因组测序，共产生 32.66 G 原始数据（Raw data）。过滤后获得32.475 G 有效数据（Clean data），各样本的Clean data 在9.880～12.177 G，所有样品Q30≥91.52%，GC 含量在44.3%～47.59%；通过与日本晴参考基因组比对，各样品比对率均在95.36%以上，4×覆盖度（至少有4 个碱基的覆盖）在87.48%～97.69%（表3）。由此可知，各样本数据量足够，测序质量高，测序数据比对结果正常，可用于后续的变异检测及相关分析。

表 3 过滤后的数据统计表Table 3 Statistics on data after screening

将亲本谷丰B 和日本晴测序结果比较，共筛选1 756 964 个SNPs 和409 345 个InDels 位点，数量足以覆盖到整个基因组；各染色体SNP 和InDel 分布密度分别在4.037～5.902 个·kb−1和0.967～1.300 个·kb−1（表4）。这些多态性位点可被进一步用于基因的定位及关联分析。

表 4 SNPs 和InDels 在水稻12 条染色体的分布Table 4 Distribution of identified SNPs and InDelsk in 12 chromosomes of rice

2.4 BSA-Seq 鉴定谷丰B 抗性基因连锁区间

利用SNP 位点分析2 个混合池△SNP-index，以95%置信水平作为筛选的阈值进行全基因组扫描。结果（图2）发现，位于第6 号和第11 号染色体的2 个区域出现了超过临界值水平的峰，推测这2 个区域为稻瘟病抗性关联区域。其对应日本晴基因组上的位置为Chr.6: 10 082-111 397 kb 和Chr.11: 120-266 kb，其中6 号染色体的关联区域包含Pi2/9 抗病位点，而11 号染色体关联区域为新的稻瘟病抗性遗传位点。

图 2 第6 号和第11 号染色体关联区间部分区段所对应的物理位置Fig. 2 Locations of corresponding regions in Chromosome 6 and Chromosome 11

为了精细定位谷丰B 抗稻瘟病基因，从6 号染色体的关联区间筛选出了4 006 个SNPs 和623 个InDels标记，从11 号染色体的关联区间筛选出了752 个SNPs 和195 个InDels 标记。

3 讨论与结论

抗谱宽、抗性强且持久的抗源是挖掘抗病基因资源，研究稻瘟病抗性分子遗传机制的理想材料，如谷梅4 和子预44。Deng 等[11]从谷梅4 中鉴定了1 个广谱持久抗瘟性新位点Pigm，并系统解析了Pigm持久抗病机制；子预44 是一个云南地方粳稻品种，截至目前已从该品种挖掘出抗不同稻瘟病菌株的主效基因Pi-zy（t）、Pi-zy3（t）、Pizy6（t）、Pizy4（t）和微效基因[12]。本研究人工接种鉴定结果表明，谷丰B 基因组中可能携带了广谱高抗稻瘟病基因。通过抗性遗传分析以及利用BSA-seq 方法，鉴定到2 个稻瘟病抗性关联位点（分别为Chr.6: 10 082-11 397 kb 和Chr.11: 120-266 kb）决定了谷丰B 对501-3 菌株的抗性。其中，6 号染色体关联区域可能和Pi2/9 基因座有关，而11 号染色体关联区域可能是新的稻瘟病抗性遗传位点。

Pi2/9 是公认对稻瘟病抗性育种有重要应用价值的位点，位于水稻第6 染色体短臂端。截至目前，已报道该基因座上至少有9 个稻瘟病抗性基因（Pi2、Piz、Piz-t、Pi9、Pi40、Pi50、Pi26、Pigm、Pi2-2），其中Pi2、Pi9、Pi50 以及Pigm 已被成功克隆[11,13−14]。张柱坚等[15]利用抗性基因标记鉴定谷丰B 可能存在Pigm、Pi-d2 和Pi-d3。结合本研究结果，表明谷丰B 对501-3 菌株的抗性是由Pigm 决定的。但有意思的是，研究发现单独突变Pi-d2 或Pigm均能够导致谷丰B 丧失对501-3 菌株抗性[15]，说明谷丰B 的稻瘟病抗性可能受多个位点共同影响。本研究发现一个新的关联区域（Chr.11: 120-266 kb 区域）也可能对谷丰B 抵抗501-3 菌株侵染起关键作用，该区域包含25 个水稻基因（数据来源于NCBI 数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。深入研究将有助于明确广谱高抗稻瘟病遗传构成及其分子机制。

广谱持久高抗的抗源常作为优良供体材料，应用于抗病分子育种。然而研究人员时常发现在选育过程中培育的新材料相比于原始供体亲本，其抗谱变窄。这种现象的根本原因在于，我们对亲本广谱高抗稻瘟病遗传构成及其内在机制缺乏了解，限制了分子标记辅助选择准确、有效的应用。本研究结果可为后续合理利用谷丰B 抗病亲本培育抗病品种提供有效信息。