臭椿生物碱对5 种植物病原真菌的抑制作用

李永春，赵美荣，张 智

（1. 东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 赤峰学院化学与生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

0 引言

【研究意义】当前，大约80%的植物病害是由真菌引起的，施用化学药剂是植物病害防治的主要手段[1]。然而化学药剂的长期施用给生态安全和人类健康带来威胁，因而，从植物中寻找具有农药生物活性的天然代谢物，成为开发新型生物农药和发现先导化合物的一种有效途径[2−3]。【前人研究进展】臭椿Ailanthus altissima（Mill.）Swingle，苦木科臭椿属植物，为我国本土树种，在国外被称为“天堂树”，是一种优势植物资源，在农业、医药等领域都有一定的开发利用价值[4]。臭椿的叶、茎皮、根皮、种子等常作为“土农药”，用于杀虫[5−6]、除草[7−8]、抗植物病害[9−10]等农业生产中。臭椿含有苦木素、生物碱、萜类化合物、黄酮类物质等多种活性成分[11]，其中生物碱是其主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎杀菌、抗寄生虫等作用[12−13]。近年来，臭椿生物碱的抑菌性能受到广泛关注，研究表明，臭椿生物碱对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、变形链球菌等有较强的抑菌活性[14−15]。【本研究切入点】此类抑菌研究多集中在医药领域，关于臭椿生物碱对植物病原真菌抑制作用的研究还鲜见报道。【拟解决的关键问题】为了探索臭椿生物碱在植物病原真菌防治中的应用，本研究以5 种植物病原真菌为供试菌，分析臭椿粗生物碱及其分离物对供试真菌生长的影响，探讨其抑菌作用，以期筛选出抑菌活性成分，为开发环境友好型的绿色植物源抑菌剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 供试材料：臭椿（干燥茎皮），购于安徽亳州中药材批发市场，粉碎至60 目，备用。主要试剂：PDA 培养基（海博生物），95%乙醇、氨水、盐酸、二氯甲烷、乙酸乙酯等均为分析纯。

1.1.2 供试菌种 黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.cucumerinum）由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供，禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、冬瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.benincasae）、芍药灰霉病菌（Botrytis paeoniae）、牡丹炭疽病菌（Gloeosporiumsp.）由赤峰学院微生物学实验室提供，将5 种供试真菌活化后，于PDA 培养基上（25±2 ）℃培养6 d，备用。

1.1.3 试验仪器 BSA224 型电子天平（赛多利斯科学仪器公司），RE-52A 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），TD5A-WS 型低速离心机（湖南沪康离心机有限公司），HVE-50 型高压灭菌器（HIRAYAMA公司），VS-1300L-U 型超净工作台（苏州安泰公司），SHP-1500 型生化培养箱（金坛市金祥龙电子公司），SHZ-D（III）型循环水式真空泵（巩义予华仪器有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 臭椿粗生物碱的提取 参考胡苗芬等[14]的提取方法。称取臭椿茎皮粉500 g，加入10 倍体积的95%乙醇浸泡3 d，8 层纱布过滤后抽滤，滤液合并，减压浓缩得乙醇浸膏（Ea），将浸膏用1%盐酸溶液分散后，4 000 r·min−1离心10 min，分层，得油相（Eb）和沉淀（Ec），取酸水液用氨水碱化至pH 10 左右，加入二氯甲烷充分萃取，合并萃取液，减压浓缩后得粗生物碱（Ed）。

1.2.2 臭椿粗生物碱的抑菌活性初筛 抑菌活性测定采用菌丝生长速率抑制法[16]。称取Ea、Eb、Ec和Ed等4 种粗分离物，分别溶于1%的二甲基亚砜（DMSO）溶液，超声使其完全溶解，经0.22 μm 无菌滤膜过滤，在无菌条件下加入到灭菌的PDA 培养基中，制成2 mg·mL−1的 含 药 培 养 基。分 别 在 培 养6 d 的供试菌落边缘取直径6 mm 的菌饼，接种在含不同药液的PDA 平板中央，以不含药液的PDA 平板作对照，每个处理设置3 个重复。菌丝面向下，于（25±2 ）℃条件下培养。72 h 后十字交叉法测定菌落直径，并计算菌丝生长抑制率。菌落直径/mm= 测量菌落直径−菌饼直径，抑制率/%=（对照菌落平均直径−处理菌落平均直径）/对照菌落平均直径×100。

1.2.3 粗生物碱对供试病原菌的毒力测定 将粗生物碱分别配制为 0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000 mg·mL−1的含药PDA 培养基，接种供试菌，培养，计算菌丝生长抑制率，配制方法和抑菌活性操作同1.2.2。将抑制率换算为几率值y、药剂质量浓度（mg·mL−1）换算为对数值x，并进行毒力回归分析，计算各供试病原真菌的EC50值[17]。

1.2.4 粗生物碱Ed的分离及抑菌活性测定 粗生物碱分离采用真空液相色谱法（VLC）[18−19]。称取5 g Ed溶于二氯甲烷，拌入薄层层析用硅胶H 粉，充分混匀后除去溶剂，干法上样，洗脱剂从正己烷开始，依次用二氯甲烷、二氯甲烷∶乙酸乙酯（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4），最后用乙酸乙酯梯度洗脱，每100 mL 收集1 份，共收集21 份，薄层色谱跟踪活性成分，将单一斑点的溶液混合，减压浓缩后，获得S1、S2、S3、S4等共4 种组分，分别称取4 种组分，无菌条件下配制成 25 μg·mL−1的含药PDA 培养基，并进行抑菌活性分析。配制方法和抑菌活性操作同1.2.2。

1.2.5 分离物S2对供试病原菌的毒力及纯化鉴定 无菌条件下将S2分别配制为 1.562 5、3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0、50.000 0 μg·mL−1的含药PDA 培养基，接种供试菌，培养，抑菌活性测定。配制方法和抑菌活性操作同1.2.2，毒力回归分析同1.2.3。将一定质量的S2用丙酮溶解，4 ℃条件下重结晶，使用高效液相色谱（HPLC），通过面积归一法检测结晶的纯度，色谱条件参照文献[20]，并利用核磁共振波谱（NMR）对其进行初步鉴定。

1.2.6 数据处理 数据处理使用DPS15.10 软件，差异显著性分析采用Tukey test 和one-way ANOVA 法在a=0.05 水平下进行。

2 结果与分析

2.1 臭椿提取物的抑菌活性

臭椿提取物对供试菌的抑菌效果（图1、表1）表明，在2 mg·mL−1的条件下，4 种提取物对5 种病原菌菌丝生长的影响不同，其中，Ea、Eb、Ec对黄瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷镰刀菌菌丝生长均有明显抑制作用，但抑制率不高，均低于25%，对芍药灰霉病菌菌丝生长抑制作用不显著（P＞0.05）。与Ea、Eb、Ec的抑菌效果相比，Ed对供试菌的抑制作用更显著，对芍药灰霉病菌的抑制作用明显优于其他3 种粗提物，抑制率为24.18%，对黄瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷镰刀菌的抑制率都在50%以上，其中对牡丹炭疽病菌、禾谷镰刀菌抑菌作用最强，抑制率达到90%以上。

图 1 5 种植物病原真菌在不同臭椿提取物的PDA 培养基上生长情况Fig. 1 Growth of 5 plant pathogenic fungi on PDA medium in presence of fractions of A. altissima alkaloids extract

表 1 臭椿粗提物对5 种植物病原真菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effects of crude extracts of A. altissima on 5 plant pathogenic fungi

表 2 Ed 对供试病原真菌的毒力Table 2 Toxicity of Ed against tested fungi

2.2 粗生物碱对供试病原菌的毒力分析

抑菌活性初筛结果表明，粗生物碱Ed对4 种植物病原真菌表现出明显的抑菌作用，继而用浓度梯度法建立了Ed对供试病原真菌的毒力回归方程，进一步分析Ed对供试真菌的抑制能力。由表2 可知，Ed对黄瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷镰刀菌都表现出了良好的抑菌性能，其EC50分别为0.55、0.41、0.35、0.31 mg·mL−1。此外，在供试病原真菌中，发现Ed对镰刀菌属的病原真菌都表现出抑制作用，其中对禾谷镰刀菌的毒力作用最强，EC50为0.31 mg·mL−1。

2.3 臭椿生物碱分离物对供试病原菌的抑菌活性

为了进一步分析抑菌活性成分，使用真空液相色谱法将Ed分离，得到S1、S2、S3、S4等共4 种组分。以5 种植物病原真菌为供试菌，对4 种分离组分进行了抑菌活性测定，抑菌效果见图2、表3。在25 μg·mL−1条件下，4 种分离物对供试真菌的作用效果不同。与对照相比，S1对冬瓜枯萎病菌菌丝的生长有一定的促进作用，对其他4 种供试菌菌丝生长没有明显的影响，S3和S4对5 种供试菌的影响也无显著差异（P＜0.05），表明这3 种组分没有明显的抑菌活性。除芍药灰霉病菌外，S2对其他4 种供试菌都表现出了明显的抑制活性，对黄瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷镰刀菌，菌丝生长抑制率分别为34.07%、36.55%、21.67%、62.28%。

图 2 5 种植物病原真菌在不同粗碱分离物的PDA 培养基上生长情况Fig. 2 Growth of 5 plant pathogenic fungi on PDA medium in presence of separated components of A. altissima alkaloids extract

表 3 粗碱分离物对5 种植物病原真菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effects of separated components on 5 plant pathogenic fungi

2.4 臭椿分离物S2 对供试病原菌的毒力分析

臭椿生物碱分离组分S2对供试菌的毒力分析见表4，试验结果进一步表明了组分S2对供试的4 种病原真菌菌丝生长都具有良好的抑制作用，且抑制作用均与S2浓度呈正相关，其中对禾谷镰刀菌的毒力作用最强，EC50为20.32 μg·mL−1，其后依次为牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌。

表 4 S2 对供试病原真菌的毒力Table 4 Toxicity of S2 against tested fungi

3 讨论与结论

臭椿作为一种优势资源植物，在抑制植物病原真菌方面有着较大的潜力。许多研究发现臭椿提取物具有抑制植物病原菌菌丝生长的作用。Balkan 等[21]研究发现臭椿叶片提取物具有抑制某些谷物病原真菌的能力。张燕宁等[22]采用生长速率法测定了56 种植物甲醇提取物的抑菌活性，结果发现，臭椿的甲醇提取物具有较强的抑菌活性，对5 种植物病原真菌的生长抑制率均在80%以上。周江鸿等[9]研究了16 种园林植物粗提物对黄栌枯萎病菌的抑制作用，发现臭椿叶提取物对黄栌枯萎病菌菌丝生长有较强的抑制作用，抑菌效果达98.53%。生物碱作为臭椿的主要成分之一，其抑菌性能备受关注。刘继梅等[23]研究结果表明，含有效成分生物碱的臭椿提取物对番茄霜霉病菌、西瓜枯萎病菌等显示较强的抑菌活性。本研究结果也发现，臭椿粗生物碱对5 种供试菌，黄瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、芍药灰霉病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷镰刀菌等的抑制效果明显优于臭椿乙醇提取物（P＜0.05），除芍药灰霉病菌外，臭椿粗生物碱对其余4 种供试真菌都具有较强的抑制活性，其中对牡丹炭疽病菌、禾谷镰刀菌抑制率达到90%以上。

为了进一步分析臭椿生物碱的抑菌活性成分，对臭椿生物碱进行单一组分的分离并测定分离组分的抑菌活性。本试验采用了快速、高效的VLC 法初步分离臭椿粗生物碱，得到4 种单一组分。单一分离组分的抑菌活性分析结果发现，仅组分S2表现出抑菌活性，且抑菌效果明显。通过毒力测试，发现S2对黄瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷镰刀菌的EC50分别为51.95、44.33、46.67、20.32 μg·mL−1，与生物碱粗提物（Ed）相比，单碱的抑菌能力要优于粗生物碱。用HPLC法测得S2的纯度为95.6%，重结晶后含量大于98%。经NMR 鉴定且与文献[23−24]比较，该化合物为铁屎米-6-酮生物碱。

另外，研究发现，单一成分的生物碱对芍药灰霉病菌菌丝生长没有明显的影响，粗生物碱对芍药灰霉病菌虽有一定的抑制作用，但相比其他4 种供试菌，抑制效果不大。无论是单一成分还是粗生物碱对黄瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷镰刀菌等镰刀菌和牡丹炭疽病菌都表现出较强的抑制作用，这一结果说明臭椿生物碱对植物病原真菌生长抑制作用具有选择性。

综上所述，臭椿粗生物碱以及单一成分铁屎米-6-酮生物碱对黄瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌、冬瓜枯萎病菌、禾谷镰刀菌都产生较强的抑菌活性，在抑制植物病原真菌方面表现出一定的应用潜力。然而，臭椿的活性成分复杂多样，其抗菌活性成分并不唯一。赵春超等[25]研究发现，臭椿种子含有的黄酮类化合物和木脂素类物质也具有抗菌作用。王乐飞等[26]也报道从臭椿根皮中分离得到的臭椿萜酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌显示较弱的抑制活性。因而对于臭椿中其他抗菌物质成分，还有待进一步探索，臭椿作为植物源抑菌剂的潜在应用价值还需做深入的研究。