排连珠状蚕粪症状蚕病的鉴定研究——以云南省祥云县蚕区为例

范永慧，张永红，王永生，吴银吉

（云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，蒙自市 661101）

祥云县是云南蚕桑产业发展的重点县之一，现有桑园面积6 866.7 hm2，2019 年全县年发种量约15万张，鲜茧产量约0.6万t，蚕桑综合产值达34亿元［1］。现已建成青坡、松梅、新泽等30多个蚕桑重点村和科技示范村。2018—2019 年，各蚕区已零星出现排连珠状蚕粪的病蚕，当地蚕农根据经验初步诊断为细菌性肠道病，但没有引起足够重视。2019 年8 月初开始饲养的正秋蚕普遍发生该病，尤其是最大的养蚕村——松梅村受影响最严重，具体情况为饲养量约4 500张，受此病害损失近1 000张，造成蚕农经济损失惨重。

通过调研发现，这种蚕病在3龄蚕中发生较少，5龄起蚕后病势严重，随即迅速扩散，至第3～4 d 暴发，肉眼观察病征表现为群体发育不齐，食桑量少且不活泼，继而蚕体变小，最后停止食桑死亡，蚕体腐烂；撕开病蚕体壁观察中肠，肠内桑叶很少，充满黄绿色液体。病蚕最显著特征就是排连珠状蚕粪，具体表现为几颗蚕粪之间有丝相连，像一串念珠，也可表述为念珠状蚕粪。查阅相关文献资料可知，排连珠状蚕粪或念珠状蚕粪的蚕病分别有细菌性肠道病［2-3］、浓核病［4-6］、黑尾病［7］、壁虱病［8］，另外，氯虫苯甲酰胺导致蚕中毒［9］也会出现排连珠状蚕粪。

家蚕浓核病毒（Bombyx mori Densovirus，BmDNV），又称家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV），BmDNV 存在不同的株系和基因组类型（BmDNV 1～6 型、BmDNV-Z 型），中国流行的病毒以BmDNV-1（伊那株）和BmDNV-3（桐乡株）的分离株为主。笔者对病蚕的中肠进行镜检，未发现球形细菌，结合上述几种蚕病的主要病征和蚕户养蚕各环节技术操作情况及低温多湿的饲养环境，初步推测为家蚕浓核病，但需通过PCR 分子检测方法和感染试验近一步来确认是否为BmDNV。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 家蚕品种 菁松×皓月，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所家蚕研究室提供。

1.1.2 病毒取样 家蚕浓核病毒BmDNV的病蚕样品采集于云南省祥云县正秋蚕期的排连珠状蚕粪蚕病最严重，发病量高达20%以上的松梅村的4家农户。

1.1.3 引物和主要试剂 根据GenBank 数据库上已登陆的BmDNV-3 株基因组片段VD1 ORF2 序列设计特异性引物（表1），由上海生工生物工程公司合成。PCR反应体系（10×PCR buffer、dNTPs和Ex-Taq聚合酶）、50×TAE电泳缓冲液、琼脂糖购于上海生工生物工程公司。

1.2 病毒生物学鉴定方法

1.2.1 检测依据 根据NCBI 已报道BmDNV-3（DQ017268）基因组VD1 ORF2序列（大小为975 bp）设计特异性引物，通过PCR 产物大小来判断采集的病蚕样品是否感染BmDNV。

1.2.2 病毒粒子收集与基因组提取 取病蚕中肠组织用灭菌水研磨，纱布过滤匀浆液，4 000 rpm离心20 min，过滤数次，收集病毒混合液加到含1 mL基因组抽提液（10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；0.1 mol/L EDTA，pH 8.0；0.5%SDS）的离心管中同时加入蛋白酶K 在55 ℃下水浴消化2 h；用Tris平衡酚、酚∶氯仿（1∶1）、酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶l）、氯仿各抽提1次；用无水乙醇沉淀基因组，70%乙醇洗涤DNA，最后用适量TE溶液溶解沉淀，溶液用于PCR检测［10］。

1.2.3 病毒基因组PCR扩增检测 参照张永红等［10］方法以抽提的病毒基因组作为模板进行PCR 扩增，反应体系：10×PCR Buffer（Mg2+）5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，cDNA 模板1 μL，Ex-Taq DNA 聚合酶0.25 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至50 μL；反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，在72 ℃下终止延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶检测。

1.3 病原感染力、感染症状试验方法

将病毒混合液涂抹于桑叶背面，稍晾干后分别添食于4 龄起蚕和5 龄起蚕，各龄添毒分A、B、C 和CK 4 组。A 组直接添食病毒混合液，B 组添食稀释10倍的病毒混合液，C组添食病毒混合液，每天添食1 次盐酸环丙沙星（人用），1 粒兑500 mL 水。CK 组饲喂正常叶，4 龄添食每组50 头蚕，5 龄添食每组30头蚕，3个重复，饷食添毒1次后开始饲喂正常桑叶，家蚕饲养置于同一温湿度环境下，操作方法一致，每天给桑3次，观察记录家蚕的生长状况、病情及病程，并解剖症状明显、尤其是排连珠状粪便的蚕儿，观察中肠病变。最后，分别收集添食4龄起蚕和5龄起蚕发病后的病蚕，提取病毒粒子及病毒基因组再次进行PCR扩增确认。

2 结果与分析

2.1 病毒生物学鉴定的PCR检测结果

祥云县4 户蚕农病蚕样品抽提基因组后，VD1 ORF2上下游引物进行PCR扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶检测发现与目的片段大小基本一致的条带（图1），初步确定该地区2组（第3和第4）样品家蚕感染BmDNV。

图1 祥云县4个样品的病蚕基因组BmDNV3--F/R PCR扩增检测结果

2.2 病原感染力、感染症状试验

2.2.1 4龄添食感染试验结果 96 h后CK组全眠，B、C 组眠1/2，A 组大多数不眠（图2），B 组未眠蚕排连珠状粪便。120 h后，A、B、C组未眠蚕出现排连珠状粪便，A组蚕整体比其他组瘦小，且只有1/3蚕眠，未眠蚕爬于饲养盒壁，食桑量很少，蚕体瘦小，尾角后方粘有一粒不成形蚕粪，B、C 组个别未眠。156 h后，5 龄饷食，A 组未眠蚕排褐色液体，逐渐停止食桑，蚕体缩短，体色为米黄色，和5 龄起蚕颜色很相似。5龄第1 d到第6 d，A、B、C每组每天均出现排连珠状蚕粪蚕儿（图3、图4），对照CK组，蚕体开差程度表现为：A 组＞B 组＞C 组（图5、图6），食桑量表现为：A组＜B组＜C组。5龄第3 d，A组和B组体色不转青，排稀粪，蚕体缩小，现死蚕，C组与CK组对照，除个别体色不转青，其余并无差别。5 龄第6 d，C 组蚕儿开始爬边，体躯比CK组小，体色较CK组体色偏黄。A 组和B 组出现的死蚕，皮干皱缩呈米黄色，不易腐烂（图7），解剖可见中肠肠腔前端没有桑叶，中部充满淡黄色肠液，肠液中有较少绿色桑叶（图8）。

图2 不眠蚕

图3 排连珠状蚕粪

图4 排连珠状蚕粪

图6 4龄添食群体发育状况

图7 病死蚕

图8 排连珠状蚕粪蚕体解剖

2.2.2 5龄添食感染试验结果 前3 d和CK组无明显变化，第4 d的A、B组现排连珠状蚕粪个体，第5 d的A 组食桑量减少，蚕体瘦小，体色偏黄，第8 d 的CK 组正常上蔟，A 组蚕体开差大于B 组，C 组和CK组无差别，只是个别不结茧，第9 d上午的结茧数为C组＞B组＞A组。

家蚕添食带毒桑叶试验中，4 龄起蚕添毒后第3～4 d出现明显症状，5龄起蚕添毒后第5～7 d出现症状。主要症状表现为：初始阶段群体中出现食桑逐渐减少、行动迟缓、爬于蚕座边缘、排连珠状蚕粪，眠期表现为迟眠或不眠，不蜕皮或半蜕皮，中期体色由青白转成米黄色，体躯瘦小，体长缩短，排稀粪，末期停止食桑，平伏于蚕座至死亡的个体。

通过病蚕样品PCR 检测初步确诊，再到添毒试验发病病症的相似，结合再次对添毒发病蚕进行PCR检测（图9所示，第1～3头为4龄添食发病蚕、第4～6 头为5龄添食发病蚕），最后可以确诊祥云蚕区排连珠状蚕粪症状的蚕病为家蚕病毒病浓核病。

3 讨论与建议

3.1 讨论

由于排连珠状蚕粪或念珠状蚕粪的蚕病有多种，由此，在云南祥云县发生的排连珠状蚕粪症状的蚕病可能不是同一种病，但都具有很强的传染能力，且造成了一定的经济损失。不同蚕病的发病机理、发病过程、饲育环境也不同，结合祥云县蚕病病征、饲料质量管理、蚕室内外环境、养蚕人员的皮肤无红疹状和发痒、发病急缓等情况，可以排除是黑尾病、壁虱病、氯虫苯甲酰胺导致的蚕中毒［7-9］造成的危害。家蚕在高温、多湿、低质饲料和饲养管理差等不良条件的冲击下容易引起细菌性肠道病［11］；低温、多湿、叶子差等不良饲养管理则易引起浓核病。随着抗BmNPV家蚕品种的应用推广，细菌性肠道病的发生更为普遍。本次试验为能更好地区别浓核病和细菌性肠道病，主要通过从病蚕获得病原为主要依据，再给家蚕添食病原辅以添食抗生素进一步确诊。在本次添毒试验中，C 组的蚕儿发育情况表明，盐酸环丙沙星可能对浓核病毒有一定的抑制作用，其相关的抑制机理还有待进一步研究。另外，5龄添食病原比4 龄添食发病慢、发病轻的情况可以看出，随着蚕儿龄期的增长，蚕体抵抗力在不断增强。试验情况与发病蚕区5 龄3～4 d 暴发，病死蚕腐烂有所不同，原因可能是与养蚕季节、环境、饲养数量和感染龄期等有关。试验经过PCR分子检测方法和感染试验可确定该蚕病属病毒病浓核病，为祥云县蚕区的下一步蚕病防控提供依据。

3.2 建议

根据家蚕浓核病的发病规律及该病流行病学的特点，在防治时必须贯彻“预防为主，综合防治”的方针，同时提高蚕农防控意识，加强桑园科学管理与饲养管理。

3.2.1 增强蚕农消毒防控意识，掌握科学的防治措施 BmDNV主要通过食下传染［11］，蚕座中的垂直感染是造成浓核病蔓延的主要原因之一，BmDNV也可能通过病蚕尸体及蚕室土壤实现病毒的越冬，所以要强化“三消一洗”的消毒防病工作，各项具体操作要落实到位。养蚕前，做好蚕室、贮桑室、蚕具、蔟具、饲养区域的清洗及消毒，消灭越冬病原，切断传播途径；养蚕结束后认真搞好“回山”消毒，及时清理病死蚕尸体、蚕粪、及霉烂的蚕茧等，将蚕室、大小蚕具、蔟室蔟具等洗净并彻底消毒，防止病原扩散，有效降低病原越冬基数；蚕期要抓好眠起处理，注意观察青头蚕、迟眠蚕，发现病蚕，正确诊断，及时隔离淘汰病蚕，进行蚕体蚕座消毒，防止蚕座传染。建立和严格执行经常性的防病卫生制度。加强蚕农的消毒防病意识，促使其掌握消毒的技术要点，选择有效的消毒药物和科学的消毒方法。消毒方法如下［2］：①用2%甲醛溶液在25℃的环境温度下保持湿润状态20 min；②用0.3%漂白粉溶液在23 ℃的环境温度下保持3 min；③用0.5%石灰浆在23 ℃的环境温度下保持3 min进行消毒，均可灭活BmDNV或先用1%的新鲜石灰浆消毒再用含有效氯1%的漂白粉液或2%甲醛溶液进行消毒能有效的抑制浓核病及其他蚕病的发生和传播［12］。

3.2.2 加强桑园与饲养管理，增强蚕儿体质 首先因地制宜选择桑树品种，做好肥水管理，根据各龄期采摘适熟叶，保证蚕儿营养需求，加强蚕室内气象环境控制，创造适温适湿的饲养环境；其次要做好小蚕共育，共育出强健无毒的小蚕；再次由于桑螟、桑卷叶蛾是BmDNV的健康带毒者［13］，采取农业防治与化学药物相结合做好病虫害防治，防止病原以桑叶作为媒介传染家蚕。