水稻遗传转化研究进展

彭小群，王梦龙

（惠州学院生命科学学院，广东惠州516007）

0 引言

水稻是世界上的主要粮食作物之一，约一半的人口以其为主食。随着人口的不断增长和生活质量的逐步提高，人们对水稻的产量和品质提出了更高的要求。因此，如何提高水稻的产量和品质是当今农业生产面临的重大问题之一。传统的水稻育种方法是通过利用物种间的杂交优势来提高水稻的产量与品质，但有限的种质资源以及较长周期的聚合育种大大限制了水稻育种的快速发展。基因工程技术的出现，解决了物种之间的隔阂问题。目前可通过转入外源基因或基因编辑的方法来改变水稻的相关性状，从而获得人们所需要的各种水稻品种，而这些技术方法的实现都离不开水稻的遗传转化。所谓水稻的遗传转化，是指把分离到的目的基因导入到水稻体内，并使目的基因在水稻体内稳定表达和遗传。随着水稻基因组测序的完成，水稻已成为了一种重要的单子叶模式植物，供众多研究者所使用。遗传转化作为一种重要的研究手段，目前已被广泛应用于水稻研究的各个方面，包括基因功能研究、T-DNA插入突变体库构建和农艺性状改良等。本综述主要对水稻的遗传转化方法及特点，农杆菌介导的水稻遗传转化研究进展和影响因素等方面做简要综述。

1 常见水稻遗传转化方法

随着基因工程技术的不断发展，20世纪80年代末到90年代初，人们便开始利用PEG法、电激法、脂质体法、基因枪法和花粉管通道法等方法进行水稻遗传转化，这些方法属于基因导入直接转化法[1-2]。直到20世纪90年代中期，农杆菌介导法才开始应用于水稻的遗传转化，并逐步得到广泛应用[1-2]。

1.1 PEG法

PEG法是一种建立和应用较早的细胞融合方法，其原理是通过利用聚乙二醇等作为介质在pH较高的条件下诱导外源DNA进入原生质体。PEG能促使外源DNA与细胞膜之间发生黏连，通过改变膜表面电荷使细胞膜的通透性发生改变，然后经原生质体的内吸作用使外源DNA进入原生质体，并随机整合到染色体上，最后经原生质体再生形成完整的植株。利用该方法，目前已经在多种禾谷类作物中获得了转基因植株[3]。如Zhang等[4]通过PEG法成功获得了含有GUS基因的转基因植株。1992年，丁群星等[5]对PEG法进行研究时发现PEG浓度、PEG的处理时间和质粒DNA的转化浓度等都会对转化效率有着不同程度的影响。PEG法对原生质体细胞的伤害较少，可有效避免嵌合体的产生，同时也不受受体细胞的限制，可转化较大片段的基因等。不足之处是该方法耗时较长，对基因型的依赖较强；并且该方法以原生质体为转化受体，容易产生白化苗，转化效率较低，因此人们尚未普遍应用PEG法进行水稻的遗传转化[1,6]。

1.2 电激法

电激法又称之为电穿孔法，与PEG法相同的是它也是以原生质体为受体，其原理是通过高压脉冲使细胞膜形成瞬间通道，从而可使外源DNA穿过。该方法最先开始应用于动物细胞，随后在单、双子叶植物和真菌中都得到应用[7]。刘明华等[8]通过电激法成功将玉米转座因子Ac/Ds导入水稻花药悬浮细胞并再生成植株。肖成江等[9]的研究表明电激法的转化效率受到电激条件、蔗糖浓度和质粒DNA浓度的影响。电激法适合瞬时表达，具有操作简单和转化率高等特点，但使用的仪器价格较为昂贵，并且在电穿孔时易损伤原生质体，会导致其再生率降低等[10]。通过将PEG法与电激法相结合，可大大提高转化效率[2]。随着电激法的不断发展，现可通过电激法直接在植物组织或细胞上打孔，从而将外源基因成功导入植物细胞[1]。

1.3 脂质体法

脂质体法是指通过利用脂类物质所合成的双层膜囊结构将基因包裹成球状，然后导入到原生质体或细胞中，从而成功实现遗传转化。根据操作不同可分为两种类型：一种是脂质体融合法，即通过将脂质体与原生质体进行共培养，使它们之间发生膜融合，经原生质体的吞噬作用可使脂质体内携带的外源基因转入原生质体，最后经原生质体的再生培养而产生新的植株；另一种是脂质体注射法，即通过显微注射方法把含有外源基因序列的脂质体注射到目标细胞内，即可成功进行转化[2]。脂质体转化法具有较高的DNA包装能力、低免疫原性，并可进行大规模生产[11]；此外，该方法操作简单、对细胞毒性小[12]。朱祯等[13]用脂质体法将α-干扰素基因成功转入水稻原生质体中，并获得了转化植株。Matthews等[14]用脂质体法成功将大肠杆菌RNA和DNA导入胡萝卜原生质体，并证明脂质体介导的大分子转入原生质体的效率与脂质体本身成分有关。由于脂质体法的转化效率较低，约只有电激法的五分之一，因此脂质体介导的遗传转化未得到普遍应用。有研究证明，在脂质体法转化过程中加入一定量的PEG可有效提高转化效率[15]。

1.4 基因枪法

基因枪法的原理是通过将外源基因包被在金粒或钨粒表面，在高压条件下可将微粒高速射入细胞，外源基因即可随机整合到植物基因组中。基因枪法由美国康奈尔大学Sanford于1987年最早提出，而Klein最早将基因枪法进行应用[16]。基因枪可分为火药式基因枪、压缩气体型基因枪和高压放电型基因枪3种类型[17]。基因枪的靶受体十分广泛，包括悬浮细胞、原生质体、叶圆盘、根或茎的切段、愈伤组织、种子胚分生组织和幼胚等[18]。Oard[19]通过基因枪转化法成功获得了转基因水稻愈伤组织，并检测到GUS基因的表达。卢萍等[16]研究表明基因枪轰击参数、微弹射程和受体的生理因素等都可影响基因枪法的转化效率。基因枪法具有受体范围广泛、操作简单、可控性高等优点，并且利用基因枪法可同时转化多个基因[7]。不足之处是基因枪轰击具有随机性，导致外源基因的整合位点极不固定，产生的转基因后代容易突变，因此不利于外源基因的稳定表达[20]；此外，基因枪价格非常昂贵，并且转化费用高，导致其没得到广泛的使用。

1.5 花粉管通道法

花粉管通道法是指通过植物受精时形成的花粉管通道将外源基因导入受精卵，并最终整合到受体基因组。花粉管通道法遗传转化可在2个不同阶段进行，一个阶段是在花粉尚未受精之前，将外源基因进行花粉转化，从而整合到精核基因组中，最后通过受精得到转化植株；另一个阶段是在植物完成受精后，在受精卵细胞尚未形成完整细胞壁和核膜系统前，可将外源基因通过花粉管通道进入受精卵，转化无完整细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，然后通过生物自身的种质系统或细胞结构功能来实现外源基因的成功转化[17]。花粉管通道法是通过利用自然生殖过程，可有效避开植株再生问题。花粉管通道法最早是在矮牵牛中得到应用，如1980年Hess[21]利用花粉管通道法获得了花色变异子代矮牵牛。Zhou等[22]利用花粉管通道法成功将DNA导入到棉花花粉管中，获得了抗枯萎病的品种。王才林等[23]通过花粉管通道法，成功将抗除草剂Bar基因转入水稻品系‘E32’中。已有研究表明，外源DNA的分子结构、DNA片段的大小和导入液的浓度等都对花粉管通道法的转化效率产生影响[24]。花粉管通道法具有操作简单，花费的时间和金钱较少；但也存在诸多缺点，如技术还相对不完善，缺乏对相关转化机制的系统性研究，操作具有一定的随机性和盲目性，并且转化效率较低等[25]。

1.6 农杆菌介导法

现今应用最多的是农杆菌介导法。农杆菌介导法是天然状态下存在的转化系统。农杆菌(Agrobacterium)广泛存在于土壤中，属于革兰氏阴性菌。目前水稻遗传转化常用的农杆菌有根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenis)两种，其中根癌农杆菌中含有Ti(Tumer induce)质粒，发根农杆菌中含有Ri(Root induce)质粒。Ti质粒和Ri质粒都含有一段T-DNA(TDNA region)，即转移DNA(Transfer DNA)，也被叫做T区。在感染植物时，根癌农杆菌或发根农杆菌能将Ti质粒或Ri质粒中的T-DNA区通过植物伤口进入细胞，并最终整合到基因组中[17]。T-DNA转入植物是植物与农杆菌相互作用的结果，而Vir区基因群在其中起非常重要的作用[1]。农杆菌介导法转化时发生的基因转移是一种自然行为。农杆菌介导法最早应用于双子叶植物的转化，随着转化载体和转化方法的改进，农杆菌介导法也在单子叶植物中逐渐得到推广应用[1]。早在1986年，Baba等[26]用PEG法将农杆菌与原生质体融合，获得了能够合成胭脂碱的水稻愈伤组织。这个实验的成功尝试，拉开了农杆菌介导水稻转化的序幕。农杆菌介导法具有费用低、易操作、基因沉默少、稳定性好、拷贝数低和便于遗传分析等诸多优点，因此受到全世界水稻育种家的青睐，被广泛应用[7]。农杆菌介导法取得的巨大成功主要得益于最佳受体材料的选择、促进Vir基因的活化、减少农杆菌对受体的伤害、菌种和质粒组合的选择等几个方面[1]。

2 农杆菌介导法在水稻中的研究

农杆菌介导的水稻遗传转化研究开始于20世纪90年代中期，并得到不断改进发展[2]。1993年，Chan等[27]用农杆菌介导法对粳稻幼胚进行遗传转化，成功获得了转基因植株。1994年，Hiei等[28]通过对农杆菌介导的转化方法进行改进，使转化效率达到了28.6%，农杆菌介导的水稻转化取得突破性进展。Rashid等[29]利用农杆菌介导法成功转化籼稻水稻，为农杆菌介导法在籼稻上的使用奠定了基础。林拥军等[30-31]以对农杆菌介导的水稻转化进行研究，成功建立了粳稻和籼稻高效率的农杆菌转化体系。Toki等[32]通过以诱导生长5天的水稻成熟胚愈伤组织进行农杆菌转化，成功获得了转基因植株，该方法不仅避免了体细胞在继代过程中可能产生的突变，而且大大缩短了转化周期，从而可快速获取转基因植株。苏益等[33]对粳稻诱导8天的早期愈伤进行转化，同样也快速获得了转基因水稻植株。Lin等[34]采用穿刺法对粳稻进行农杆菌转化，该方法无需进行愈伤的诱导，因此进一步缩短了转化周期。Saika和Toki的研究发现籼稻栽培品种‘Kasalath’的愈伤组织转化效率是粳稻‘日本晴’的10倍[35]。Ozawa和Takaiwa的研究表明用悬浮培养的‘日本晴’愈伤组织进行转化，效率可提高5～ 10倍[36]。Shri等[37]在对籼稻转化进行研究时，发现通过改变培养条件和在共培养基中加入L-半胱氨酸可将转化效率由12.82%提高到33.33%。高璐和薛永来通过2,4-D诱导水稻成熟种子，发现诱导7天的愈伤组织与农杆菌共转化时效率最高，而抗性愈伤的筛选时间以2～ 4周为最佳[38]。

3 农杆菌介导的水稻遗传转化影响因素

农杆菌介导的水稻转化技术在当今世界发展已经较为成熟。随着农杆菌介导法的不断应用，人们将注意力逐渐转向如何提高效率上。研究表明，农杆菌介导的水稻遗传转化效果与农杆菌的侵染能力、水稻细胞转化应答能力和转化因子再生能力有关[2]。已知影响农杆菌介导的水稻遗传转化效率有两方面：一是农杆菌的侵染体系；二是水稻的再生体系和组织培养。

3.1 侵染体系对农杆菌介导的遗传转化影响

在农杆菌的侵染体系中，菌种与载体的正确选择会极大影响转化效率。不同的菌种具有不同的宿主范围，所以同一宿主选择不同的菌种进行侵染，其转化效率也会有所不同[2]。如用EHA105、LBA4404和AGL1三种农杆菌侵染愈伤组织时，它们对愈伤组织的转化能力存在一定差异，其中EHA105的侵染转化能力最好。另外，侵染时选择的菌浓度和侵染时间不同也会对转化造成一定的影响[39]。

3.2 再生体系和组织培养对农杆菌介导的遗传转化影响

在水稻的再生体系中，不同的品种，其可培养性也存在巨大差异。虽然粳稻、籼稻和瓜哇稻都已建立起农杆菌介导的转化体系，但它们的转化效率差异较大。通常粳稻容易转化，而籼稻转化较难，因此选择正确合适的受体是实现基因成功转化的先决条件；并且同一受体采用不同的外植体，其对转化的效率也有重大影响，如水稻幼胚的转化效率高于成熟胚[2]。

再生系统还需要有合适的培养基与之相对应，否则同样难以实现成功转化。在组织培养过程中，通常会通过在培养基中加入一定量的激素来促进细胞分裂、诱导愈伤和生根等，并且不同的品种其所需激素的最适浓度也不一样。例如在愈伤组织形成方面，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是必须成分。不同的水稻品种其诱导愈伤组织形成的最适2,4-D浓度不同。如张燕红等[40]以新疆主栽品种‘秋田小町’为研究材料时，发现当2,4-D浓度为2 mg/L时，其综合诱导效果最好，愈伤组织的诱导率可达93.87%；而尹梅等[41]以水稻‘滇优粳3号’和‘滇优粳5号’为实验对象时，发现4 mg/L的2,4-D才是诱导愈伤较合适的激素浓度。值得一提的是，前人的研究表明2 mg/L的2,4-D才是诱导滇优粳稻愈伤组织的最佳浓度[42]，这说明水稻在经过长期的培养后，其愈伤组织对不同浓度物质的敏感度有所改变。

3.3 其他因素对农杆菌介导的遗传转化影响

在对农杆菌介导的遗传转化进行研究中，一些研究者还在愈伤组织的分化效率方面开展了相关研究。如郑杰[43]在提高抗性愈伤组织的分化效率实验中，从已去壳种子的消毒时间、愈伤组织继代培养时间和农杆菌侵染浓度3个方面入手，通过对前人的实验条件加以改进，发现种子消毒30 min、继代培养6～ 7天的愈伤组织和农杆菌侵染浓度OD600值为0.145～ 0.190时，种子的诱导率和愈伤组织的转化率都处于一个较高的水平。周蕾和陈晨[44]的实验同样也证实了该结果。此外，周蕾和陈晨[44]对影响农杆菌介导的水稻遗传转化各因素进行研究时发现光照诱导愈伤比暗培养诱导缩短了约一周的时间，且诱导率也有所提高。

4 展望

水稻是中国的主要粮食作物，也是进行植物研究最重要的模式植物之一。建立高效快速稳定的水稻遗传转化体系，是开展水稻基因功能研究和进行水稻性状改良等科学研究的基础。经过近30年的发展，水稻遗传转化技术在世界范围内得到广泛应用。以PEG法、脂质体法、电激法、基因枪法、花粉管通道法和农杆菌介导法等方法为代表的水稻遗传转化方法都得到较大发展，其中尤以农杆菌介导法发展最为迅猛，并得到广泛应用。目前在水稻中应用最多的是农杆菌介导法。相比于其他方法，农杆菌介导法具备更多的优点，因此备受研究者青睐。近年来虽然水稻农杆菌介导法的研究取得较大发展，但仍存在诸多问题，如籼稻材料转化效率较低，转化容易产生农杆菌污染，转化时间还相对较长等。综合以上，未来水稻农杆菌介导法研究应重点解决以下几个方面的问题：（1）选择合适的籼稻受体转化材料进行转化和合适的农杆菌菌株进行愈伤组织侵染；（2）适当降低农杆菌侵染浓度和侵染时间、减少农杆菌与愈伤组织的共培养时间；（3）选择易于快速诱导愈伤的外植体、连续的光照和合适的光强与温度进行培养。