胶原蛋白的制备、生物学特性及应用

厉盈颖，张俊杰，吴志明，马德蓉

江苏海洋大学食品科学与工程学院（连云港 222000）

胶原蛋白是动物体内非常重要的一类功能性蛋白质，在动物体内含量最多、分布也最广，可占蛋白总量的25%～30%[1]。作为一种结缔组织蛋白，胶原在动物的皮肤、软骨、跟腱、韧带等众多的组织和器官中均有分布，目前市场上所应用的各种胶原类产品，也大都是通过动物组织来提取加工得到的。长期以来，牛、猪等陆生动物一直都是胶原蛋白的主要提取来源，但由于疯牛病、猪流感、口蹄疫等各种牲畜传染病的爆发，以及一些地区的宗教文化影响，人们也在不断寻求胶原蛋白的其他获取途径[2]。

与明胶以及胶原蛋白肽类物质相比，从动物组织中提取的胶原蛋白，具有典型的胶原三股螺旋结构，是拥有完整四级结构的生物大分子，这也是胶原蛋白区别于明胶以及胶原蛋白肽类物质最重要的特点。特殊的结构赋予了胶原蛋白优良的生物相容性、止血性、可降解性等生物特性，同时还能与组织及细胞间产生良好的相互作用，具有促进细胞的增殖分化以及伤口愈合等功能。作为一种优质的天然高分子生物材料，胶原蛋白在生物医学材料领域也是得到了越来越多的研究与应用。

1 胶原蛋白的制备

1.1 原材料的选择

胶原蛋白根据其基因编码组合的不同可以分为许多类型，目前已发现了28种胶原蛋白的类型[3]。不同类型的胶原蛋白在动物体内分布各异，其含量也有很大差别。Ⅰ型胶原蛋白分布最广，可以从皮、腱、筋、骨等众多组织中提取；Ⅱ型胶原蛋白主要由软骨组织提取，一般都以猪、牛、羊等动物的软骨组织作为提取材料；Ⅲ型胶原蛋白可以从胚胎真皮、心血管等组织中提取；Ⅳ型胶原蛋白是基底膜的主要成分，可以从富含基膜的组织中提取，例如晶状体囊、角膜后弹性膜等；Ⅴ型胶原蛋白可以从角膜、胚胎绒毛膜、胎盘等组织中提取。此外还有许多其他类型的胶原蛋白，广泛分布在不同的机体、不同的组织内，可以通过适当的工艺来提取、纯化，同时也有部分胶原蛋白尚处于研究阶段，迄今为止还未探究出完整的制备方法[4]。

1.2 胶原蛋白的提取工艺

胶原蛋白的提取方法有许多，例如酸提法、酶提法、中性盐提取法、碱提法等，根据不同的胶原蛋白可以选择不同的提取方式，但其基本的原理都是通过改变蛋白质的环境条件来使胶原蛋白从其他蛋白质中分离[5]。中性盐提取法应用的较少，它适用于组织中新合成的胶原，这部分胶原交联程度较低，可溶性高，通常采用0.15～1 mol/L NaCl溶液提取。碱提法是将组织原料在碱性溶液中浸泡提取胶原蛋白，而碱性的条件容易使胶原蛋白变性，产生消旋现象，从而影响胶原蛋白结构[1]。

目前酸提法和酶提法是胶原蛋白提取工艺中最常用的方法，因为组织中绝大部分胶原交联程度高，需要在酸性条件或酶处理后才能溶解。其中，酶提法由于其反应速度快、提取率高，所得胶原蛋白纯度高、性质好，目前也是用作生物材料的胶原蛋白最常用的提取方式。Duan等[6]用乙酸浸提黑鱼皮，得到胶原粗提液，并通过盐析、复溶、冻干等步骤得到了酸溶胶原蛋白，将酸提后的不溶物用含胃蛋白酶的乙酸按上述方法处理，得到酶溶胶原蛋白，两种方式均在4 ℃条件下进行，得到的胶原蛋白样品保持了良好的三螺旋结构。

1.3 胶原蛋白的分离纯化

从组织中提取的胶原蛋白往往都容易掺杂一些杂质，同时，从同一组织中也往往能提取出不同种类型的胶原蛋白，所以要想得到纯度较高、或是某单一类型的胶原蛋白物质，就必须通过分离纯化来实现。常用的胶原蛋白纯化方法有盐析、透析、离子交换色谱、超滤等，目前实验室中最常用的是盐析-透析结合法，利用蛋白质在高盐条件下因溶解度降低而被析出的特点，将胶原蛋白从溶液中沉降出来，并通过透析的方式去除盐溶液，进而得到纯化的胶原蛋白[7]。李赛娜等[8]在牛软骨Ⅱ型胶原提取液中加入了3 mol/L NaCl溶液，在22 ℃下盐析32 h后，得到了纯化的Ⅱ型胶原蛋白，回收率可达91%，样品纯度为92.2%。

2 胶原蛋白的生物学特性

2.1 低免疫原性

胶原蛋白的免疫原性很低，甚至在1954年以前，胶原蛋白被广泛认为是不具备抗原性的[9]。尽管后来有研究表明胶原蛋白会与抗体相互作用，但其依旧是一种低抗原性蛋白质。胶原蛋白的抗原决定簇有三类，第一类是胶原蛋白的完整三螺旋结构引起的；第二类是三螺旋结构中的氨基酸序列引起的；第三类是位于胶原蛋白非螺旋末端区的端肽引起的，其中端肽是引起胶原蛋白免疫原性的主要因素，在天然胶原和变性胶原中均存在。因此，在提取过程中，可以通过添加蛋白酶来去除端肽，以降低其免疫原性。然而，去除端肽后的胶原蛋白不便于交联，因此，针对应用于组织工程领域的胶原蛋白，则需要保留其端肽，以获得高强度的生物组织材料，这部分胶原蛋白可以通过戊二醛交联等方式来降低其免疫原性[10]。

2.2 生物相容性

胶原蛋白是生物体结缔组织中的重要成分，能与宿主细胞和组织之间产生良好的相互作用，具有诱导细胞增殖、分化等功能。胶原蛋白的特殊三螺旋结构为细胞外基质构建了网络支架，能对细胞起到锚定和支持的作用，为细胞提供了增殖分化的良好环境[11]。胶原蛋白可以促进不同种类细胞的生长，对细胞的分裂也具有一定作用，此外，胶原蛋白还能够增加细胞的黏结，并对细胞的形态、运动等起到控制作用[1]。

2.3 可生物降解性

胶原蛋白是一种可生物降解的特殊物质，在胶原酶的特异性作用下，胶原蛋白的肽链被切割，其三螺旋结构受到破坏，使得胶原蛋白被降解成各种片段。这些胶原片段会通过两种方式发生进一步的降解，一种是在体温条件下自发变性，变性的胶原蛋白片段在酶的作用下被降解成氨基酸或寡肽，从而被人体吸收利用或代谢排出；还有一种是通过细胞的吞噬作用，例如结缔组织细胞和炎症细胞等，都能将胶原片段吞噬，并通过溶酶体将这些片段进一步降解[12]。

2.4 止血性

胶原蛋白具有良好的止血作用，原因在于其能促进血小板凝集，形成血栓，从而达到止血的目的。血管受到损伤后，血小板会与血管内皮下的纤维胶原直接接触，血小板被激活，释放出颗粒成分，从而促进凝血，达到止血的目的。利用这样的特点，胶原蛋白可被有效运用于生物止血材料的制备，但在利用胶原蛋白制备心血管装置时，则必须抑制胶原蛋白和血小板之间的作用，防止凝血，目前在制备胶原蛋白生物材料时，常采用戊二醛交联或肝素化合物涂敷等方式，来防止胶原蛋白与血小板的作用[13]。

2.5 高机械强度

胶原蛋白是由三条左手螺旋的多肽链，相互缠绕形成右手超螺旋结构的高分子蛋白质，这种特殊的三螺旋结构使胶原蛋白具有很高的机械强度，同时，胶原蛋白分子内和分子间的各种次级键也对维持胶原蛋白的稳定性起着非常重要的作用。利用这种特性，胶原蛋白可以在生物缝合线、敷料、以及组织工程器官的研制中发挥重大的效用。此外，胶原蛋白还可与交联剂交联来进一步提高其机械强度，可根据生物材料的制备需求，采用不同的交联剂，使用不同的交联方法，得到不同机械强度的胶原蛋白产品[14]。

3 胶原蛋白生物材料的应用

3.1 医疗器械领域

3.1.1 敷料

敷料是医学领域非常常见的一种材料，具有治疗伤口感染、防止体液流失、促进组织再生以及伤口闭合等作用[15]。敷料可分为传统敷料、生物敷料、合成敷料以及复合敷料四类，其中生物敷料以其毒副作用小、与人体组织相容性良好、抗原性低、有良好的生理活性等优点，逐渐成为医用敷料中一种接近于理想要求的敷料。胶原蛋白目前也被广泛应用于生物敷料的研制，胶原蛋白敷料能吸收大量组织渗出物，防止伤口干裂，促进凝血，利于表皮细胞的增殖修复，还可被生物体降解吸收，可用于治疗不同病原的皮肤损伤[16]。

3.1.1.1 海绵敷料

胶原蛋白海绵是由胶原蛋白溶液制成的海绵状固体制剂，可以有效地吸附血小板，促进创面凝血，还可用于各种组织器官的填充与修复，是胶原蛋白生物材料中非常重要的一种产品形式。Ueda等[17]采用热交联的方式，在胶原蛋白海绵中引入转化生长因子TGF-β1，并将其应用于颅骨缺损的家兔中，6周后，颅骨缺损的部位被新形成的骨所覆盖，其治疗效果远优于空白组。Lewis等[18]将N-羟基琥珀酰亚胺官能化聚乙二醇（NHS-PEG）与胶原蛋白海绵结合制成止血敷料，用于凝血障碍患者。通过大量的临床研究可知，NHS-PEG胶原蛋白海绵可以有效运用于创口止血，具有凝血速度快、止血效果好，不易产生血肿等优良特点。

3.1.1.2 膜敷料

将胶原蛋白制成膜运用于烧伤等创伤，也是胶原蛋白用作敷料的一种形式，其制作工艺非常简单，就是在胶原蛋白溶液中加入各类有效物质，然后置于平皿内加热，使其蒸发成膜。胶原蛋白膜具有低抗原性、可灭菌性等优良特性，能良好地缓解创面疼痛，且成本低，适用于供皮区和浅表皮层等干净、干燥的伤口[19]。高智仁等[20]采用氨熏成膜法和盐析法制备猪皮胶原蛋白膜，通过动物实验发现采用胶原蛋白膜覆盖的小鼠在创伤愈合程度上要明显优于对照组，可见胶原蛋白膜可以有效应用于表层创伤治疗。腊蕾等[21]在胶原蛋白基质中加入了吲哚美辛，在37 ℃加热3 h后得到了乳白色半透明、光滑、具有弹性的胶原蛋白膜。由于吲哚美辛具有消炎、止痛的效用，所制备得到的复合型胶原蛋白烧伤膜能有效地促进伤口愈合、防止创面感染。

3.1.1.3 凝胶敷料

胶原蛋白凝胶的含水量很高，有良好的生物相容性和软组织相似性。将胶原蛋白凝胶用于烧伤敷料，能在创面形成一层保护膜，防止创面受污染，且胶原蛋白具有许多生物性功能，更有利于创口皮肤组织的修复与愈合。胶原蛋白凝胶易与创面渗出液结合，不会出现积液、积脓的现象，可以有效避免对患者伤口的二次伤害，这也是凝胶敷料区别于其他敷料最突出的优势。高智仁等[22]将磺胺嘧啶银与胶原蛋白凝胶结合制备得到复合凝胶敷料，通过临床试验，发现其对烧伤创面的治愈具有良好的效用，同时具备优良的抗感染效果，可见胶原蛋白凝胶与抗菌药物复合制备的创伤敷料可以更满足临床的需求。杨小红等[23]在猪腱Ⅰ型胶原中加入西黄芪胶、甘油、氧氟沙星等，制备了Ⅰ型胶原蛋白复合凝胶敷料，将此敷料运用于褥疮的治疗，试验结果显示，使用复合凝胶敷料的Ⅱ°褥疮病人均在2～3周内愈合，Ⅲ°褥疮病人在4周内明显好转，其治愈效果与对照组相比，具有非常显著的差别。

3.1.2 手术缝合线

手术缝合线在外科手术中起着至关重要的作用，手术切口、器官移植、创口止血等均需要运用手术缝合线。根据生物降解功能可以把手术缝合线分为不可吸收和可吸收缝合线两种，前者无法被机体降解，容易产生组织反应，且需要通过后期拆线来从人体中移除，容易使创口留下伤疤，而可吸收缝合线能被生物体降解吸收，具有良好的生物相容性，既避免了对患者的二次伤害，也不会引起机体的排异反应。

由于胶原蛋白各种优良的生物学性质，将其运用于可吸收缝合线也是目前较为热门的研究方向。胶原蛋白制成的缝合线生物相容性好、纤维结构强韧、具有良好的止血效果等优点，一般采用湿法纺丝工艺来制备胶原蛋白缝合线，将原料配置成混合液，经过滤、去泡等处理后，通过一定压力压入纺丝泵进行喷丝，而后进入凝固浴中成型，再经交联、干燥、收卷等一系列操作，最终得到胶原蛋白缝合线成品[24]。郭振友等[25]以牛胶原蛋白为原料制备得到的缝合线具有易打结、生物相容性好、无创口副作用等优点，且其打结强度远超于美国药典标准，被广泛应用于临床。

3.2 组织工程领域

3.2.1 人工皮肤

早期大都是以胶原蛋白敷料作为人工皮肤来修复患者的各类创面，而随着组织工程的出现，人工皮肤与胶原蛋白敷料的概念也就逐渐被区分。胶原蛋白在人工皮肤中的应用，是以胶原蛋白为基质构建生物支架来为细胞提供生长环境，使得具有活性细胞的胶原蛋白人工皮肤能被运用于患者的各类创面，从而促进伤口的愈合。朱堂友等[26]在鼠尾I型胶原中加入了壳多糖、透明质酸、肝素等物质，得到了复合胶原蛋白凝胶，并将角质形成细胞接种于凝胶上进行细胞培养，制成了含有活性细胞的胶原蛋白-壳多糖复合人工皮肤，有效提高了创面的抗菌能力，防止伤口感染。Kuroyanagi等[27]将成纤维细胞接种于胶原蛋白海绵，制备得到真皮替代物，将所制备的人工皮肤应用于145例不同的伤口，结果显示，皮肤烧伤和深度皮肤烧伤的治愈率可达96%，创伤性皮肤缺损治愈率达91%，褥疮和Ⅱ度创伤治愈率可达100%。

3.2.2 人工角膜

胶原蛋白由于其优良的生物特性，对于角膜细胞的形态与生长起着非常重要的作用。胶原蛋白角膜可以保护并促进角膜创口的修复，且有利于释放抗生素、抗菌药物、抗青光眼药物等多种有效物质[11]。赵世红等[28]以猪巩膜为原料制备得到干态胶原蛋白角膜，并通过浸泡的方式引入药物分子，所得人工角膜在眼碱烧伤患者中的治愈率可达74.19%，可见所制备的角膜胶原蛋白膜对眼部碱烧伤的治疗具有非常良好的效用。Myung等[29]使用异型双功能交联剂将角膜中的Ⅰ型胶原蛋白共价交联至聚乙二醇/丙烯酸聚合网络水凝胶中，构建了一种生物聚合物。通过对比无胶原蛋白交联的水凝胶可以发现，经过胶原蛋白交联的生物凝胶物质能明显支持角膜细胞的生长，且能有效支持伤口愈合。

3.2.3 人工骨

构建组织工程化人工骨的支架材料一般有两类，一类是人工合成材料，另一类是天然生物材料，人工合成材料经降解后容易产生酸性物质，对细胞和组织的生长带来一定的影响，天然生物材料机械性能差，也不适宜单独用作支架材料，因此现在都是研究复合型人工骨，一般都将羟基磷酸钙与胶原复合来制备人工骨，因为这两种成分是动物、人体中骨骼的主要成分[1]。Moran等[30]将纯化的牛胶原蛋白与羟基磷酸钙、β-磷酸三钙和自体骨髓混合制成了人工骨，并将人工骨和自体骨分别移植入两组骨折病人体内，并进行对比。结果发现两组病人的愈合率相同，复合骨组的感染率要明显低于自体骨组，可见复合人工骨可以替代自体骨用于骨折创伤，具有良好的安全性和有效性。

4 结语与展望

就目前而言，我国的胶原蛋白生物材料主要来源于牛、猪等陆生动物组织，而我国作为水产大国，可以充分利用丰富的水产资源来开发运用水产胶原蛋白，根据目前的研究看来，从水产副产物中提取的胶原蛋白具有良好的凝胶性、低粘度性等特点，可在某些方面替代陆生动物组织胶原蛋白，不仅能有效运用于胶原生物材料的研发，也利于提高水产品的附加值，同时，胶原蛋白获取途径的不断开拓，也会使不同来源胶原蛋白产品的开发成为广大学者的研究方向。

胶原蛋白在生物医学材料等领域有着非常广泛的应用，而组织工程的出现更是为胶原蛋白的应用提供了一个前景广阔的平台，目前所形成的包括缝合线、各类医用敷料、组织工程材料等在内的许多产品，在实验及临床研究中均取得了很大的成功，但是，目前市场上真正广泛使用的胶原产品较少，部分产品还未投入批量生产，同时新产品的开发也需要进行长期、大量的实验研究与临床验证，因此，胶原蛋白用作生物材料的研发，还需要实验人员和生产者们进一步深入研究，这也将是生物技术时代的重要研究内容之一。

同时，国内针对胶原蛋白及胶原蛋白相关产品的标准较少，且部分企业标准对产品的定义尚未明确，容易使消费者混淆。随着我国胶原蛋白行业的发展以及越来越多相关产品的研究开发，将胶原蛋白及相关产品标准化也显得尤为重要。