针灸疗法调控microRNA在基础实验中应用的研究进展*

班维固，滕秀英，齐 辉

（黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001）

关于针灸治疗机制的研究日益成熟，在国内外有着广泛的文献报道，针灸发挥治疗作用的机制被认为可能与局部微创、轴突反射、脊髓节段支配、脑内整合及脑输出等五级效应途径相关[1]，其作用机制复杂多样，仍需进一步探索验证。近年来，关于microRNA研究越来越广泛，其可参与各种各样的调节通路，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等，有研究尝试从调控microRNA角度探讨针灸治疗的作用机制。本文综述了关于针灸调控microRNA在基础研究中应用的研究进展，以期为针灸的治疗机制研究提供新思路。

1 microRNA功能及作用方式

microRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止，在动植物及病毒中已经发现有28 645种miRNA分子[2]。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。此外，miRNA是一类内生的小分子RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过1个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达[3]。据推测，miRNA调节着人类1/3的基因。最近的研究表明，大约70%的哺乳动物miRNA是位于TUs区（transcriptionunits，TUs），且其中大部分是位于内含子区。一些内含子miRNA的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA不仅在基因位置上保守，序列上也呈现出高度的同源性，miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA与其靶基因的进化有着密切的联系[4]。

近年来，miRNA对基因表达的调控已成为各疾病研究中特别关注的问题。miRNA为由18～24个核苷酸组成的非编码RNA，与靶mRNA的3'UTR处的种子序列结合，从而抑制蛋白质表达。单个miRNA可以与各种mRNA相互作用，单个miRNA可以由复杂miRNA-mRNA网络中的多个miRNA调控。miRNA表达失调被认为是各种人类疾病中的常见事件，miRNA失调涉及的疾病包括脑卒中、心力衰竭、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、慢性疲劳综合征、阿尔茨海默病[5]等。因此，miRNA具有双向作用，使其成为潜在的治疗或诊断靶标[6]。

miRNA的作用方式主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，有3种方式：

第一种是切断靶基因的mRNA分子——miRNA与靶基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以这种方式发挥作用，靶基因mRNA断裂后，无poly（A）分子的3’端加上多个U并很快降解，含poly（A）的分子能稳定存在一段时间（如拟南芥miR-171）。在植物中目前有1个miRNA和3个潜在的目标靶基因完全互补（这些scarecrow基因编码潜在的转录因子），尽管还不清楚这些基因是否就是miRNA的目标靶，这仍是第一次发现miRNA和其潜在的目标靶完全互补，也提示miRNA可能包含与siRNA类似的作用方式。

第二种是抑制靶基因的翻译——作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类（如线虫lin-4）。而在植物中极少数的miRNA通过此方式来抑制靶基因。

第三种是结合抑制——具有以上两种作用模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全结合时，起调节基因表达的作用[7]。针灸的多途径、多表达方式与miRNA作用方式高度契合，因此可从动物实验出发，探讨miRNA的调控靶点，探讨针灸治疗疾病的作用机制，以丰富针灸的作用机理。

2 针灸调控miRNA在基础研究中的应用

2.1 脑缺血再灌注

2.1.1 通督调神针灸法调控miRNA表达 针灸可通过调节不同的基因信号传导通路发挥其作用机制，不同的针灸方法及穴位所调控的基因也不同，通督调神法以补益为原则，其机制以上调血清miRNA表达为主。郑仕平等[8]采用通督调神针法治疗脑缺血再灌注大鼠，将大鼠分为电针组、艾灸组、阿司匹林组、模型组及空白对照组，治疗7 d后进行脑缺血再灌注，结果在24 h后，针刺可有效降低大鼠的神经行为学评分；针刺是通过调控miRNA-664的表达来降低脑组织基质金属蛋白9的表达，达到治疗目的；这被认为是针刺治疗缺血性脑卒中的作用机制之一。郑仕平等[9]采用通督调神针法治疗脑缺血再灌注大鼠，将大鼠分为电针组、艾灸组、阿司匹林组、模型组及空白对照组，治疗7 d后造模，在24 h后发现，与模型组比较，电针组及艾灸组大鼠miRNA-290和miRNA-494表达量均显著增高；大鼠大脑中动脉闭塞造成的脑缺血可明显改变miRNA表达，引发神经元保护，达到调控脑卒中目的；针灸可调控miRNA-290和miRNA-494的表达，降低水通道蛋白-4的表达量，减轻脑水肿。

2.1.2 针刺加亚低温调控miRNA表达 针刺加亚低温法可调控多个miRNA传导通路，通过上调或下调其靶基因达到治疗目的。何灏龙等[10]观察了针刺加亚低温对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧海马组织miRNA归属通路影响，将造模成功的大鼠随机分为针刺组、亚低温组、针刺加亚低温组及模型对照组，结果发现针刺组miRNA表达数量为16个、亚低温组为7个、针刺加亚低温组为23个，证实针刺加亚低温组可明显改善大鼠脑缺血情况，减少脑梗死面积，其机制可能与针刺调控多个miRNA传导通路有关，包括p53通路、Calcium通路、Jak-STAT通路及Neurotrophin通路等。针刺可多途径调控信号，达到保护神经元的目的。陈楚淘等[11]观察了针刺联合亚低温对脑缺血大鼠脑组织相关miRNA表达影响，将造模大鼠随机分为针刺组、亚低温组、针刺加亚低温组及模型对照组，结果发现针刺加亚低温组大鼠神经功能缺损评分及脑梗死面积均明显低于其余各组，且针刺组调控miRNA数量为16个，亚低温组为7个，联合组为23个，证实针刺可通过多途径、多靶点调控miRNA表达，其调控miRNA数量越多，在改善脑梗死面积及神经功能评分上越好，但具体的调节机制仍需进一步研究。

有研究[12-14]探讨了针刺联合亚低温对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织miRNA表达的影响，将造模大鼠分为针刺组、亚低温组、针刺加亚低温组及模型对照组，发现相对于模型对照组，其他3组均可降低脑梗死面积，降低miRNA-181表达，并认为针刺加亚低温组作用机制是通过下调p38 MAPK通路上miRNA-181表达来实现的，针刺治疗的机制与miRNA调控具有相关性。何晓婷[15]基于MAPK信号通路研究了针刺联合亚低温对脑缺血再灌注大鼠脑组织的影响，将造模大鼠随机分为针刺组、亚低温组、针刺加亚低温组及模型对照组，发现相对于模型对照组，其他3组均可降低miRNA-29c在脑组织中的表达，下调缺血侧海马组织中Map4k4的表达。针灸调控机理是基于降低MAPK信号通路上miRNA-29c及其靶基因Map4k4的表达，以及上调miRNA-29c靶基因Fem1b的表达来实现的，为针灸治疗脑缺血再灌注提供了另一种的方式。

2.1.3 针刺百会、足三里调控miRNA表达 针灸调控与经络传导有一定关联，针灸选穴多依据经络选穴。百会、足三里为补虚要穴，针刺百会、足三里可上调血清miRNA表达。徐虹等[16]观察了针刺百会、足三里对脑缺血再灌注损伤大鼠miRNA-126表达的影响，将造模大鼠随机分为针刺组、药物组、模型组及假手术组，分别于再灌注损伤第1、3、5、7天测定miRNA-126表达，针刺组miRNA-126表达明显高于药物组，针刺可以提高miRNA-126表达，以出芽相关蛋白-1和磷酸肌醇3激酶调节亚单位作为作用靶点，减轻脑血管损伤。CHEN S H等[17]研究了针刺百会、足三里对脑缺血再灌注损伤大鼠miRNA-124表达的影响，将造模大鼠随机分为模型组、针刺组和假手术组，分别于再灌注损伤第1、3、5、7天测定miRNA-124表达，并使用定量聚合酶链反应检测血清miRNA-124表达。脑缺血大鼠血清miRNA-124表达水平显著升高，模型组和针刺组大鼠miRNA-124的表达峰值均在第3天出现。针刺组在同一时间点miRNA-124的表达高于模型组，针刺大鼠百会和足三里可减轻脑缺血再灌注损伤，这与周围血清中miRNA-124的表达上调，以及整合素β1和层黏连蛋白的下调有关。这些变化可能成为针刺缓解脑缺血再灌注损伤的机制之一。王富明[18]研究证实针刺足三里、百会对脑血管再灌注损伤大鼠脑组织具有保护作用，保护机制与调控miRNA-126表达有关。

2.1.4 电针预处理调控miRNA表达 电针刺激强度更大，可下调并抑制miRNA表达并激发信号传导通路达到治疗目的。刘曌宇等[19]研究了电针预处理对脑缺血损伤小鼠海马神经元miRNA-223表达的影响，将造模小鼠随机分为电针预处理组、模型组及假手术组，检测miRNA-223表达情况，结果发现电针预处理组miRNA-223表达低于模型组，且神经功能评分显著高于模型组，证实电针预处理改善脑缺血情况与抑制miRNA-223表达相关，其作用机制可能为下调miRNA引发突触后膜上α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体下降，阻滞钙离子经该受体进入细胞，进一步减轻毒性，减少脑缺血损伤。赵俊等[20]研究了电针刺激对抑郁大鼠海马及中缝核miRNA-16表达的影响，将造模大鼠随机分为电针组、药物组、模型组及正常对照组，电针组大鼠miRNA-16表达低于药物组、模型组，针刺治疗脑血管病与调控miRNA表达高度相关。柳维林[21]基于miRNA介导突触可塑性，进一步探讨了电针对缺血性脑卒中模型大鼠学习记忆功能的影响及作用机制，研究发现电针治疗可提高缺血性脑卒中大鼠的记忆学习能力，其作用机制为抑制脑卒中模型大鼠miR-219a的表达，上调靶基因蛋白激酶，促进下游环磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化，从而促使学习记忆相关蛋白的合成，发挥治疗认知障碍的作用。

上述研究中选用的百会、足三里为补虚要穴，通督调神法以补益为原则，针灸干预的作用机制均以上调血清miRNA表达为主。补虚与泻实相对，但对于泻实未见相关报道，仍需进一步探索以泻实为原则，针灸干预对血清miRNA表达的影响。针灸调控miRNA是多途径、多靶点、多通路的，这与经络错综复杂的循行路线有一定关联。

2.2 心肌缺血再灌注损伤 针灸调控miRNA保护心肌细胞是通过多通路、多途径、多靶点实现的。针灸干预心肌缺血再灌注损伤的机制为调控部分基因表达上调，部分基因表达下调。这与经络系统密切相关，经络能调节人体的机能活动，使之保持协调、平衡。当人体的某一脏器功能异常时，针刺等治疗方法可激发经络的调节功能，从而使功能异常的脏器恢复正常。针灸治疗心肌缺血多以补虚泻实为治疗准则，针灸调控miRNA基因的表达是补虚泻实的作用过程。卢继东[22]运用标本配穴取穴方法，研究电针对心肌缺血大鼠细胞凋亡miRNA的调控机制，选用心肌缺血模型大鼠作为研究对象，随机分为标本配穴组、电针组、正常组及模型组，治疗22 d后行荧光定量PCR法检测大鼠心肌组织miRNA-133-3p、miRNA-133-5p、miRNA-1-3p、miRNA-486表达。研究结果表明，标本配穴组miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表达高于电针组及模型组，miRNA-1-3p、miRNA-486低于电针组及模型组，证实多个miRNA基因参与了心肌细胞凋亡代谢过程，“标本配穴”电针法通过调控miRNA-133-5p与Caspase-3、Aifm2之间的基因来防治心肌缺血，主要是上调miRNA-133-5p表达和降低Caspase-3、Aifm2表达达到治疗心肌缺血的目的。柳培雨[23]基于miRNA-214/Ca2+信号通路研究了电针干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用机制，将造模大鼠随机分为假手术组、电针组、正常组，测定miRNA-214表达情况，证实电针可上调miRNA表达情况，抑制钙离子和CypD等相关蛋白的升高，发挥保护心肌作用；同时将H9c2细胞随机分为Sham组、氧糖剥夺组（OGD组）、氧糖剥夺+电针+miRNA-214沉默组（miR-NC组）、氧糖剥夺+电针+miRNA-214过表达组（miR-214组），发现miR-214组细胞凋亡情况及血浆乳酸脱氢酶水平、肌酸激酶活性、钙离子水平均较低，因此电针可通过miRNA-214/Ca2+信号通路干预心肌缺血-再灌注损伤。卢继东[24]探讨了电针内关穴对心肌缺血大鼠细胞凋亡相关miRNA表达的影响，将造模大鼠随机分为正常组、模型组和电针组，并检测心肌细胞miRNA-133a、miRNA-133b、miRNA-208、miRNA-499的表达量，结果发现电针组miRNA-133a、miRNA-133b表达量高于模型组，miRNA-208、miRNA-499的表达量低于模型组，因此电针主要是通过上调miRNA-133a、miRNA-133b表达，下调miRNA-208、miRNA-499的表达，达到保护心肌细胞、减少心肌损害的目的。王华等[25]探讨了电针不同腧穴对心肌缺血模型大鼠心肌细胞miRNA表达影响，将大鼠随机分为电针内关组、标本配穴电针组、正常组及模型组，治疗21 d后，检测心肌细胞miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208、miRNA-499的表达，结果发现标本配穴电针组miRNA-133表达高于电针内关组及模型组，而miRNA-1、miRNA-208、miRNA-499表达低于电针内关组及模型组，标本配穴电针和电针内关均可调控心肌细胞凋亡，保护心肌细胞，且标本配穴电针疗效更为显著。上调miRNA-133表达，下调miRNA-1、miRNA-208、miRNA-499表达，为针刺治疗心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用机制。

2.3 慢性疲劳综合征 针灸调控miRNA治疗慢性疲劳综合征的机制主要为上调miRNA基因表达，通过多途径抑制细胞凋亡，达到治疗该病的目的。朱昕昀[26]研究了针刺对慢性疲劳综合征认知功能障碍大鼠海马miRNA-184表达的影响，发现针刺可明显改善大鼠的认知障碍，提高学习及自主探索能力，认为可能与听宫上调海马中miR-184表达，激活海马中5-羟色胺通路、抑制Caspase-3蛋白表达、进而抑制神经元进一步凋亡相关。杨蕾[27]研究认为慢性疲劳综合征患者外周血中存在异常表达的miRNA，这可能与调节免疫炎症反应、氧化应激反应和能量代谢等相关信号通路有关，进而调控慢性疲劳综合征的发生发展进程。针刺治疗可有效缓解患者疲劳程度，减少紧张或焦虑及注意力不集中等心理症状，这种效应机制可能与针刺下调miR-122表达等相关信号通路有关。

2.4 膝骨关节炎 针灸调控miRNA治疗膝骨关节炎的机制为促进miRNA表达水平，调控信号通路，降低炎症反应，抑制细胞凋亡。林道冠等[28]基于miRNA-30b-5p/TLR4/NF-κB轴，研究针灸干预膝骨关节炎大鼠的作用机制，发现单一针灸及联合治疗可促进miRNA-30b-5p的表达，降低TLR4这一作用靶点，降低炎症因子，抑制膝关节细胞的凋亡，为针灸靶向治疗提供了基础。叶静[29]研究发现针刺治疗可有效缓解膝骨关节炎患者膝关节疼痛，改善关节活动功能，并发现膝骨关节炎患者与健康受试者血清外泌体miRNA的差异表达明显，针刺干预能下调膝骨关节炎患者血清外泌体miR-1228-5p、miR-1296-5p、miR-3168的信号通路表达。针刺可能通过调控患者MAPK信号通路、细胞凋亡、细胞自噬及代谢等途径,发挥治疗作用。刘君伟[30]研究了温针灸对兔膝骨关节炎软骨组织的影响，温针灸治疗兔膝骨关节炎的机理可能是通过降低Bax、Caspase-3表达，上调Bcl-2 miRNA水平，抑制软骨细胞凋亡，从而发挥治疗作用。

2.5 炎症性疾病 目前关于针灸调控miRNA的基础研究中，以脑缺血再灌注损伤和心肌缺血再灌注损伤研究最为常见，除此之外尚有部分基础研究以炎症性疾病为主，如溃疡性结肠炎、肠易激综合征、慢性萎缩性胃炎等。针灸可通过调控miRNA表达治疗上述炎症性疾病，降低机体炎症反应，下调炎症因子指标。这与经络系统密切相关，经络有感应刺激和传导信息的作用。当人体的某一部位受到炎症刺激时，刺激可沿着经络传入脏腑，使其发生相应的病理变化。病理反应通过经络反应于体表。针刺可通过经络感应和传导功能作用炎症部位，miRNA表达与经络密切相关，调控miRNA表达可促进经络的循行与传导，达到治疗疾病的目的。

2.5.1 溃疡性结肠炎 针灸调控miRNA治疗溃疡性结肠炎，主要作用机制为上调结肠组织的miRNA表达水平。李毅等[31]研究发现miRNA及其靶基因在溃疡性结肠炎病变发展过程中具有重要调控作用。顾沐恩等[32]研究发现，隔姜灸天枢穴对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织黏膜损伤具有一定的保护效应，这与结肠组织miRNA基因表达密切相关，尤其是miR-139-5p、miR-204和miR-184的表达有关。王倩[33]研究发现，艾灸关元、足三里可对结肠炎产生干预效应，其作用机制一部分是通过升高MUC2 miRNA和EGFR miRNA表达来实现的，其基因表达多为上调。这与虚则补之的治疗原则相对应，所选穴关元、足三里为补益要穴。

2.5.2 肠易激综合征 吴立斌[34]研究发现艾灸天枢、上巨虚对腹泻型肠易激综合征大鼠的腹泻症状和结肠炎症有明显改善作用，这与结肠组织β-防御素-2及mRNA表达升高有密切关系。陆高[35]研究发现针刺可能通过调控肠易激综合征患者体内miRNA的表达，间接调控下游蛋白分子的表达，从而改善腹痛等症状。其作用机制为调控针灸-miRNA-免疫调节、针灸-miRNA-神经系统保护、针灸-miRNA-细胞保护、针灸-miRNA-肿瘤抑制等通路，其miRNA表达通路为15个。

2.5.3 慢性萎缩性胃炎 黄艳等[36]研究发现，隔药饼灸可不同程度地逆转慢性萎缩性胃炎大鼠外周血清oxo3、Uba52、S100a1、Nod2的mRNA表达水平。罗淑瑜[37]研究发现热敏灸能下调胃黏膜c-myc mRNA、survivin mRNA基因的表达，恢复胃黏膜细胞增殖与凋亡之间平衡而达到治疗慢性萎缩性胃炎的目的。

2.6 睡眠剥夺 针灸调控miRNA改善睡眠剥夺是通过平衡miRNA表达实现的，由于下丘脑神经递质失调引发失眠，针灸通过调控其信号通路保持平衡，改善睡眠。吴雪芬[38]运用针刺治疗失眠大鼠，发现针刺能通过上调5-HT1a miRNA及下调5-HT2a miRNA表达实现镇静安神作用。郭鑫[39]研究发现针刺改善大鼠失眠与调节血清单胺类神经递质含量和MT1-miRNA、MT2-miRNA的表达有关，通过下调MTI和MT2表达达到改善睡眠质量的目的。魏歆然[40]研究发现针刺百会、神门可以改善睡眠时间及睡眠潜伏期，提高VLPO区的Clock mRNA的表达量，达到镇静安神作用。郭保君[41]发现针刺调理跷脉能够有效缩短入睡潜伏期、延长睡眠时间，这与提高大鼠视交叉上核内Clock mRNA、Per2 mRNA相对表达量有关。

2.7 多囊卵巢综合征 针灸调控miRNA治疗多囊卵巢综合征是通过平衡卵巢组织的miRNA表达、改善内环境实现的。研究[42]发现多囊卵巢综合征患者的卵泡液、颗粒细胞、卵泡膜细胞及脂肪组织均存在特殊的miRNA差异表达谱，miRNA可以调节卵泡发育和激素合成，参与多囊卵巢综合征的发生。林鸾[43]研究发现穴位埋线能够明显改善多囊卵巢综合征大鼠生殖内分泌紊乱，促进卵泡正常发育和排卵，进一步降低大鼠雄激素水平，解除高雄激素血症对miR-125b表达的抑制，使miR-125b表达上调，降低靶基因FSHR mRNA表达，进而促进卵泡的正常发育，达到治疗疾病的目的。

3 总 结

针灸可通过调控miRNA表达，借助传导通路的作用，达到靶向治疗的目的，且miRNA表达数量越多，针灸可调控途径越广泛，针灸能通过多途径及综合靶向治疗发挥其作用机制，达到治疗疾病的目的。另一方面，针灸调控miRNA表达与经络密切相关，经络可联系脏腑器官，通行气血，濡养脏腑组织，miRNA基因通路可能作用于经络上，发挥治疗疾病的目的。同时根据针灸补虚泻实的治疗原则，miRNA基因表达上调与下调与其可能有一定相关性。

目前的研究多以基础研究为主，研究内容多以心脑血管疾病为主，仍需进一步扩大基础研究范围。同时虽有关于针灸调控miRNA治疗疾病的临床报道[44-46]，但其样本量小，仍需大样本、双盲的随机对照临床研究进一步验证针灸调控miRNA的作用机制。