Duchenne/Becker型肌营养不良患儿基因检测特征分析

杨欣英，傅晓娜，金 洪，张 珅

首都医科大学附属北京儿童医院 神经内科，北京 100045

Duchenne/Becker型肌营养不良(DMD/BMD)是一类因编码DMD基因突变所致的X染色体连锁隐性遗传病。DMD发病率接近0.04%，多见于男性，一般发病于3～5岁，6岁即可出现行走障碍，主要死因为心力衰竭或呼吸衰竭。BMD整体症状较轻，正常行走能力可保持至16岁以上[1]。DMD基因位于Xp21.2，包括79个外显子和8个启动子，横跨2 200 kb长度DNA区域，存在极高的突变风险[2-3]。目前，BMD/DMD诊断主要依靠基因检测，而对于BMD和DMD鉴别诊断无法单纯通过基因检测完成。20世纪80年代末，国外学者提出阅读框架原则，即移码突变可形成截短且无功能抗肌萎缩蛋白，可诊断为DMD；而基因缺失因外显子阅读框未改变，临床症状轻微，可诊断为BMD[4]。目前，临床医师可通过包括Humgen、Edystrophin在内的网站检测DMD基因异常与周围外显子阅读框及临床表型间的关系[5]。考虑到BMD和DMD患儿预后的明显差异，临床亟需通过准确的分子生物学诊断及临床分型最大限度地实现基因精准治疗。本研究采用IDT捕获芯片+NGS技术完成基因筛查，旨在探讨BMD/DMD患儿临床及基因检测特征。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2020年5月至2021年5月首都医科大学附属北京儿童医院收治的54例BMD/DMD患儿为研究对象。根据BMD/DMD的诊断标准，将DMD患儿纳入DMD组(n=42)，将BMD患儿纳入BMD组(n=12)。DMD组中，患儿均为男性；就诊年龄3个月至13岁，平均年龄(4.21±1.87)岁；无血缘关系，父母非近亲结婚。BMD组中，患儿均为男性；就诊年龄4个月至14岁，平均年龄(4.07±1.79)岁。本研究设计符合《赫尔辛基宣言》要求。患儿家属均签署知情同意书。

1.2 研究方法 采集患儿外周静脉血3 ml，通过多重连接探针扩增技术完成DMD基因共79个外显子筛查，发现缺失和/或重复突变。采用NGS技术，通过MI.PA检测基因未见异常的患儿。进一步采用IDT捕获芯片+NGS技术检测单核苷酸水平突变，经Sanger法验证。阅读框架原则：BMD基因突变符合整码突变，DMD基因突变符合移码突变[6]。

1.3 家系基因检测 收集同意接受基因验证患儿母亲的外周静脉血3 ml。其中，患儿为缺失/重复水平突变采用多重连接探针扩增验证；患儿为单核苷酸水平突变采用Sanger测序法验证。

2 结果

2.1 患儿临床表现及实验室检查指标分析结果 12例BMD患儿因肌酸激酶水平异常升高或肌肉酸痛就诊。DMD患儿中，16例年龄<4岁患儿因肌酸激酶水平异常升高、行走不稳或易摔倒就诊；26例年龄≥4岁患儿因乏力、不愿行走及上楼需扶梯就诊。54例患儿肌酸激酶、谷丙转氨酶及天门冬氨酸氨基转移酶水平均异常升高，平均肌酸激酶水平(13 720±6 450)IU/L，平均谷丙转氨酶(278.56±94.20)IU/L，平均天门冬氨酸氨基转移酶(205.90±71.63)IU/L。BMD组患儿平均肌酸激酶水平为(2 815±970)IU/L，低于DMD组的(15 940±5 210)IU/L，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 基因检测资料分析 54例患儿中，采用多重连接探针扩增检测DMD基因异常共43例，其中，大片段缺失和重复突变分别为36例、7例。采用多重连接探针扩增检测基因无异常患儿再行NGS检测11例，检出微小突变7例；4例存在包含两个区域基因缺失或重复，可见典型DMD临床表现。

2.3 阅读框架原则符合率分析 43例基因缺失/重复患儿中，阅读框架原则符合率为88.37%(38/43)。29例移码突变的DMD患儿中，阅读框架原则符合率为96.55%(28/29)。14例整码突变的BMD患儿中，阅读框架原则符合率为71.43%(10/14)。

2.4 家系基因检测分析 20例患儿母亲完成验证基因检测，DMD基因阳性率为70.00%(14/20)。

3 讨论

本研究纳入BMD/DMD患儿共54例，42例DMD患儿临床症状较为严重，年龄≤4岁患儿主要表现为肌酸激酶水平异常升高或行走不稳，而学龄前或学龄儿童则可出现乏力、肌无力及行走困难；BMD患儿临床症状相对较轻，主要表现为肌酸激酶水平升高或肌肉酸痛。本研究中，患儿均可见肌酸激酶水平升高，且BMD患儿平均肌酸激酶水平低于DMD患儿(P<0.05)，提示肌酸激酶水平升高水平可在一定程度上用于BMD/DMD的鉴别诊断。此外，对于临床上原因不明的血清酶学指标(天门冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶等)升高需关注，可能存在罹患BMD或DMD的风险[6]。

有研究报道，多重连接探针扩增联合NGS测序基因突变检出率>90%，具有高灵敏度，且相比肌肉活检更经济、方便[7]。本研究采用多重连接探针扩增检测DMD基因异常共43例，其中，大片段缺失和重复突变分别为36例、7例；采用多重连接探针扩增检测基因无异常的11例患儿再行NGS检测，检出微小突变7例，整体检出率与既往研究[8]报道一致，同时，多重连接探针扩增检测结果中缺失和重复突变占比(69%比13%)也与既往研究[9]结果相近。此外，4例患儿存在包含两个区域基因缺失或重复，可见典型的DMD临床表现，而这一复杂基因重排理论上较为少见，国外研究报道中发生率仅为0.07%～1.32%[10]，但本研究占比达8%，是否与人种及检测手段差异有关仍有待探索。11例采用多重连接探针扩增检测基因无异常患儿再行NGS检测，检出微小突变7例。基因测序技术无法检测到内含子、启动子及调控区域序列致病性突变，若临床高度怀疑但未见到外显子基因异常，患者仍需肌肉活检确诊[11]。

本研究中，阅读框架原则符合率为88.37%(38/43)，与基因遗传病数据库[12]结果相近。本研究移码突变DMD患儿阅读框架原则符合率为96.55%(28/29)，整码突变BMD患儿的阅读框架原则符合率为71.43%(10/14)，其中，整码突变患儿的阅读框架原则符合率低于既往研究[13]结果，笔者认为这主要与纳入样本量较少有关。本研究发现，部分患儿基因型与临床表型不一致，且无法通过阅读框架原则进行解释，其中，3例患儿45～47号外显子缺失为整码突变，临床诊断DMD和BMD分别为1例、2例；4例患儿45～47号外显子缺失为整码突变，临床诊断DMD和BMD分别为2例、2例。进一步查阅相关基因数据库发现，45～47号和45～48号外显子缺失绝大多数表现为BMD，仅少量诊断为DMD[14]。DMD/BMD患儿基因型与临床诊断阅读框架原则不符可能与以下因素有关：(1)内含子中部分序列异常，潜在的剪接增强子激活，尽管未影响蛋白分离，但干扰后续mRNA剪接方式，从而造成临床表型与基因型不一致；(2)RNA降解控制效率间个体差异造成临床症状严重程度不同，进而导致临床表型间差异形成；(3)内含子断裂造成假外显子形成，诱导基因重排出现，假外显子被识别后，读码阅读框架原则失效，无功能抗肌萎缩蛋白表达；(4)可变剪接时外显子出现跳跃，抗肌萎缩蛋白合成后羧基末端保留，使其仍可形成效应功能，最终导致临床表型与基因型不一致[15-17]。

本研究中，20例验证患儿母亲完成基因检测，DMD基因阳性率为70.00%(14/20)。笔者认为，对于存在明确家族史的患儿，可加强遗传咨询和产前诊断，避免BMD/DMD患儿出生。约30%的BMD/DMD患儿属于散发病例，但需要注意的是，尽管这部分患儿母亲未检出基因突变，但无法排除携带致病基因异常的可能，异常可能发生在胚胎早期体细胞嵌合时或生殖嵌合卵细胞减数分裂阶段。此外，隐匿传递致病基因暴露继发突变也可能存在[18-19]。因此，合理、科学的产前诊断对于降低DMD/BMD发病率、减轻家庭及社会负担具有重要意义。

综上所述，BMD/DMD患儿具有各自独特临床及基因检测特征，阅读框架原则可能更适用于DMD预测。