Serpin B9与肿瘤及肿瘤干细胞的研究进展

王文君，王 娇，叶小群

中国全国肿瘤登记中心和美国癌症协会的数据显示，当前肿瘤新发病例数和死亡病例数均居高不下，给全世界的医疗和经济均带来沉重负担[1-2]。因此，寻找肿瘤治疗新靶点，研发抗肿瘤药物一直是亟待解决的问题。肿瘤的发生和发展受多种因素的影响。有研究发现，肿瘤免疫逃逸能够通过隐藏肿瘤细胞的免疫原性，逃避机体的免疫监管系统，从而促进肿瘤的发生和进展。因此，针对肿瘤免疫逃逸的免疫治疗应运而生，而靶向程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）/ 程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）通路治疗是其中的主要代表[3]。此外，其他的免疫逃逸机制也逐渐受到学者的关注。

丝氨酸蛋白酶抑制剂B9（serine proteinase inhibitor，Serpin B9）是一种核质分布的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其基因定位于染色体6p25 区[4]。Serpin B9 的主要作用机制是抑制颗粒酶B（granzyme B）的杀伤作用，而颗粒酶B 主要由淋巴细胞脱颗粒释放，可以发挥促细胞凋亡、抗病毒和抗肿瘤的作用。在肿瘤中，Serpin B9 能够通过抑制颗粒酶B 对肿瘤细胞的杀伤而保护肿瘤细胞，从而发挥抗肿瘤细胞凋亡的作用[5]。最新的研究指出，敲除Serpin B9 基因后可使肿瘤细胞被颗粒酶B 所杀伤，而Serpin B9 抑制剂不仅能够促进肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤的生长，还能够延长成瘤小鼠的生存时间[6]，提示Serpin B9 可能是一种新的肿瘤分子靶点。因此，本文从Serpin B9 的结构、功能及调控肿瘤组等方面，对Serpin B9 在肿瘤及肿瘤干细胞中的作用进行综述。

1 丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族

丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族是一类具有共同来源、结构序列高度同源而功能高度分化的蛋白酶抑制剂超家族，最早在人血浆中被发现[7-8]，丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族广泛存在于自然界中，包括细菌、真菌、植物和动物等，至今已鉴定超过1 000 种，按照共同的起源分为16 个亚组（A～P）。其中，在人类中发现13 个B 类亚组成员，即Serpin B1～Serpin B13[9]。丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族是一类单链蛋白，通常由350～500 个氨基酸组成，相对分子质量为（40～100）×103，其主要作用位点是蛋白酶识别域靠近其C 端的反应中心环（reactive center loop，RCL），裂解的RCL 与靶蛋白酶一起插入Serpin 的β-折叠A 中，引发Serpin 构象变化，形成稳定的共价复合物，最终导致靶蛋白酶失活[10]。研究发现，Serpin 能够抑制与炎性反应、补体、凝血及免疫有关的蛋白酶，参与肺气肿、肝硬化、血管性水肿、痴呆、糖尿病、病毒性肝炎、血栓及肿瘤等疾病的病理和生理过程[8]。近期有研究指出，Serpin B9 与人类肿瘤密切相关，能够促进肿瘤的发生和发展，提示其可能成为肿瘤治疗新靶点。

2 Serpin B9 的结构和功能

Serpin B9 最早是从人胎盘cDNA 文库中筛选出来的，包含7 个外显子和6 个内含子，编码含有374 个氨基酸的单链蛋白，相对分子质量为42×103[4]。Serpin B9 具有高度保守的三级结构，包括9 个α 螺旋、3 个β 折叠以及羧基末端1 个功能活性反应中心RCL，该区域存在1 个特异的PI-PI’位点（一对高度保守的半胱氨酸），该位点的氨基酸残基决定了蛋白酶抑制剂的特异性[11]。如前所述，Serpin B9 通过抑制颗粒酶B在机体内参与疾病的发生和发展。颗粒酶B 一般由细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和自然杀伤（natural killer，NK）细胞脱颗粒释放，是CTL/NK 细胞诱导靶细胞凋亡的重要介质[5]。Serpin B9 能在RCL 中形成二硫键，阻止PI’键被颗粒酶B 裂解，抑制颗粒酶B 的杀伤作用而保护细胞[11-12]。Serpin B9 广泛存在于人体各种组织中，包括血液、心脏、肺和肝脏，尤其是在胎盘和睾丸中，而卵巢和眼睛中也发现Serpin B9 高表达，能够抑制颗粒酶B 的杀伤作用而发挥细胞保护作用[13]。Serpin B9 有特异的丝氨酸蛋白酶抑制剂属性。越来越多的临床研究表明，Serpin B9 也是一个颇有前景的疾病诊断及预后预测指标，例如诊断血栓形成或评估炎症及病毒感染的预后[7,14]。

3 Serpin B9 与肿瘤

研究表明，肿瘤免疫逃逸是导致肿瘤发生和进展甚至治疗失败的原因之一。肿瘤的免疫逃逸是指尽管机体拥有正常的免疫监管系统，但是肿瘤仍然能够保持异质性且持续生长、侵袭和转移[15]。最早在T 细胞淋巴瘤中的研究发现，Serpin B9参与肿瘤的免疫逃逸，并且在不同程度上影响恶性淋巴瘤的免疫治疗效果[16-17]。JIANG 等[6]研究证实，Serpin B9 能够抑制颗粒酶B 对肿瘤细胞的杀伤作用而发挥保护肿瘤细胞的作用，上调Serpin B9 的表达能够促进肿瘤的发展，而下调Serpin B9 的表达则能抑制肿瘤的发展，这与近年的临床研究结果相一致。对生物信息学进行挖掘，结果提示Serpin B9 的表达与葡萄膜黑素瘤的不良预后相关[18]。同样，间变大细胞淋巴瘤研究也发现，Serpin B9 的表达与临床结局尤其是不良预后密切相关[19-20]。目前的大部分研究已证实，Serpin B9 对肿瘤具有保护作用；但也有部分研究未发现这一结果。一项结直肠癌研究发现，癌旁正常组织中Serpin B9 高表达与较好的预后相关[21]，但该研究是针对Serpin B9 在正常组织中的表达情况，而不是在肿瘤组织中的表达情况，因此不具有代表性。总之，目前的研究认为Serpin B9能够调控肿瘤细胞凋亡和肿瘤的免疫逃逸，从而促进肿瘤的发生、发展、转移和耐药等过程。

3.1 Serpin B9 与肿瘤细胞凋亡

肿瘤的发生、发展、转移和耐药等都涉及肿瘤细胞凋亡。研究认为，Serpin B9 能够保护肿瘤细胞，避免肿瘤细胞发生凋亡。肺癌相关研究指出，相较于低表达Serpin B9 的肺腺癌细胞，高表达Serpin B9 的肺腺癌细胞凋亡明显减少，表明Serpin B9 有助于肿瘤细胞对抗凋亡[22-23]。同样，高表达Serpin B9 的白血病细胞能够抵抗颗粒酶B 诱导的细胞凋亡，因此研究者认为Serpin B9的表达及颗粒酶B 的活性能够预测白血病的免疫治疗效果[19]。除此之外，研究发现Serpin B9 在肿瘤细胞中的表达差异也对肿瘤细胞凋亡具有重要意义。在小儿急性淋巴细胞白血病患者中，白血病细胞中Serpin B9 的表达差异改变了颗粒酶B 和其他杀伤细胞对白血病细胞的敏感性，尤其是Serpin B9 过表达可明显抑制移植物抗白血病效应[24]。近年来的研究还指出，Serpin B9 可能参与促进癌前病变进展为恶性肿瘤的过程。前列腺癌相关研究发现，过表达Serpin B9 能够保护前列腺癌细胞而避免其凋亡，还有研究发现前列腺的炎性反应可能触发Serpin B9 的表达上调，由此提示Serpin B9 在癌前病变阶段或肿瘤早期均表达上调，使细胞在恶变早期免于发生凋亡，进而发展为肿瘤[25]。

Serpin B9 主要通过抑制颗粒酶B 抑制肿瘤细胞凋亡，而颗粒酶B 能够通过多种机制介导肿瘤细胞凋亡。在NK/T 细胞非霍奇金淋巴瘤中，颗粒酶B 通过天冬氨酸酶依赖性和非天冬氨酸酶依赖性2 种机制诱导NK/T 细胞淋巴瘤细胞死亡，进而导致广泛性坏死[26]。此外，在某些肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）敏感性肿瘤细胞系中，Serpin B9 能够抑制TNF 及TNF 凋亡相关配体和Fas 配体介导的肿瘤细胞凋亡[27]。除了直接抑制颗粒酶B 发挥抗细胞凋亡作用以外，Serpin B9 还能协同其他的蛋白酶抑制剂抵御颗粒酶B 的杀伤作用。例如，参与抑制细胞毒性的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor involved in cytotoxicity inhibition，SPI-CI）能够保护细胞免受穿孔素和（或）颗粒酶B 的杀伤。有研究指出，SPI-CI 可与Serpin B9 协同阻止细胞毒性淋巴细胞介导的肿瘤杀伤作用[28]。上述结果均表明，Serpin B9 可以通过各种机制保护肿瘤细胞而避免其凋亡，有望成为新的针对肿瘤细胞凋亡的分子靶点。

3.2 Serpin B9 与肿瘤免疫

免疫系统对于肿瘤而言表现出双面性。一方面，肿瘤的免疫逃逸能够促进肿瘤的发生和发展；另一方面，机体的免疫防御能够杀伤肿瘤细胞甚至消灭肿瘤。Serpin B9 可能既参与了肿瘤的免疫逃逸，也参与了机体的免疫杀伤，在肿瘤免疫中扮演着复杂的角色。MEDEMA 等[29]发现，Serpin B9 表达上调是提示T 细胞免疫治疗肿瘤失败的重要参数。各类淋巴瘤研究结果均显示，淋巴瘤细胞高表达Serpin B9 能够引发机体的免疫紊乱，促进正常细胞发生恶变[30]。为更深入地研究Serpin B9，有研究采用慢病毒感染方法使Serpin B9 在人宫颈癌HeLa 细胞或人乳腺癌MCF-7细胞中过表达，结果发现高表达Serpin B9的肿瘤细胞的存活时间更长，提示Serpin B9 可能使其获得了更强的抵抗免疫杀伤的能力[31]。除此之外，霍奇金淋巴瘤患者的研究结果提供了更加直观的证据，即Serpin B9 能够通过干扰免疫系统，帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸的证据；大多数的经典霍奇金淋巴瘤细胞系均高表达Serpin B9，能够对抗增强颗粒酶B 杀伤效应的免疫治疗，从而促进淋巴瘤细胞发生免疫逃逸[32]。同样，在乳腺癌和肺癌中也观察到Serpin B9 能够增强肿瘤细胞的免疫逃逸[23,33]。鉴于Serpin B9 的重要性，研究者在Serpin B9 阳性表达肿瘤（例如复发性霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等）中构建了Serpin B9 不敏感识别颗粒酶B 的细胞系，以诱导颗粒酶B 杀伤肿瘤细胞，这或许能够成为一种新的免疫疗法[32]。临床研究也发现了相同的结果，有研究结果显示Serpin B9 的表达水平与肿瘤分期和不良预后呈正相关。例如，Serpin B9 在肺癌细胞中高表达，而肺癌细胞可以利用Serpin B9增强免疫逃逸效应，并且该作用随肺癌分期的升高而明显增强[34]。还有研究指出，Serpin B9 参与弥漫大B 淋巴瘤及霍奇金淋巴瘤的免疫逃逸，避免细胞毒性T 淋巴细胞介导的杀伤作用；生存分析结果提示，Serpin B9 也是不良预后的主要预测指标[35]。上述研究证据均表明，Serpin B9 能够增加肿瘤的免疫逃逸，促进肿瘤的发生和发展，与肿瘤的不良预后密切相关。

3.3 Serpin B9 与肿瘤发生及肿瘤细胞增殖

研究发现，Serpin B9 能够促进肿瘤发生，甚至在癌前病变中显现出类似于肿瘤标志物的价值。研究发现，相较于术后未发生皮肤鳞状细胞癌的肾移植术后患者，肾移植术后发生皮肤鳞状细胞癌患者的Serpin B9 表达水平明显升高，而且在复发性皮肤鳞状细胞癌患者中发现Serpin B9高甲基化的循环T 细胞，提示Serpin B9 高表达是肾移植术后皮肤鳞状细胞癌的高危因素[36]。此外，有研究发现不同胎龄胎盘组织滋养层细胞中的Serpin B9 表达水平存在明显差异。与早孕胎盘相比，部分和完全葡萄胎滋养层细胞中的Serpin B9 表达水平明显升高，其中以绒癌细胞系中的Serpin B9 表达水平最高。上述结果提示，滋养层细胞中Serpin B9 的表达水平与相应的免疫逃逸水平一致，并且妊娠滋养细胞中Serpin B9表达上调可能有助于肿瘤发生[37]。对生物信息学的挖掘结果也证实了这一点。口腔鳞状细胞癌肿瘤易感基因筛查结果显示，Serpin B9 在候选基因中排名第一位[38]。对儿童原发性恶性脑肿瘤的研究发现，29%在肿瘤发生期间检测出Serpin B9的表达[39]。大量研究证实，Serpin B9 是肿瘤的高危因素，能够促进肿瘤的发生，但目前鲜少研究关注具体的作用机制。

目前的研究认为，Serpin B9 能够促进肿瘤的进展。正如前文所述，研究提示当肿瘤与宿主缺乏Serpin B9 时，肿瘤进展受到明显抑制[6]。已有许多研究证实，Serpin B9 可以抑制颗粒酶B对肿瘤细胞的杀伤作用，因而促进肿瘤细胞的增殖。一项大型的肝癌队列研究发现，78.1%的肝癌组织中表达Serpin B9，明显高于癌旁正常组织的35.0%，并且肝癌组织中Serpin B9 的表达水平与肿瘤大小、分化程度和淋巴结转移及分期密切相关；COX比例风险回归模型分析显示，Serpin B9 是肝癌患者不良预后的独立预测指标，与总生存率呈负相关[40]。然而，也有研究得出了不同的结果，上调肝癌细胞中Serpin B9 的表达后，肝癌细胞凋亡率增加，而增殖能力降低；采用siRNA 下调Serpin B9 表达后，肝癌细胞凋亡能力明显降低，而增殖能力增强；由此提示，Serpin B9 的表达似乎可以促进肝癌细胞凋亡[40]。另有部分研究在其他类型肿瘤中也发现了类似的结果。在鼻型NK/T 细胞非霍奇金淋巴瘤中研究发现，Serpin B9 表达缺乏与肿瘤细胞凋亡减少以及不良预后呈正相关，提示Serpin B9 低表达甚至不表达与肿瘤进展相关[41]。虽然大部分研究证实Serpin B9 对肿瘤具有促进作用，但也有研究得到了不同的结果，由此提示仍然需要对Serpin B9 在肿瘤中的作用及其机制开展更多的研究。

3.4 Serpin B9 与肿瘤转移

Serpin B9 对于肿瘤转移而言是一把双刃剑，其不仅促进肿瘤转移，同时也保护正常的组织细胞而阻止肿瘤转移。NK 细胞能够附着于肝窦毛细血管内皮上，肝脏中的NK 细胞和肝窦毛细血管内皮细胞高表达Serpin B9 可以保护肝脏微环境免受高活性穿孔素/颗粒酶B 的破坏，维护肝脏微环境的稳定，并杀死转移性肿瘤细胞[42]。然而，另一项对结直肠肿瘤肝转移的研究则发现，下调肿瘤细胞中Serpin B9 的表达水平可以抑制结直肠癌肝转移，提示Serpin B9 表达可能促进肿瘤转移[43]。上述2 项研究着眼的角度不同，得到的结果也互相矛盾，由此表明Serpin B9 在肿瘤转移中的机制复杂。虽然部分研究得出了不同的结果，但是大多数研究均显示Serpin B9 在肿瘤中高表达可以促进肿瘤转移。一项对结直肠癌和研究结果显示，颗粒酶B 的表达水平与对结直肠癌患者较好的预后有关，而Serpin B9 的表达与淋巴结转移和不良预后有关[44]。有趣的是，在同种肿瘤细胞系中，Serpin B9 似乎还参与了不同部位的肿瘤转移。研究发现，转移至肺脏的乳腺癌细胞中Serpin B9 的表达水平较转移至其他部位的乳腺癌细胞明显升高[45]。总之，Serpin B9与肿瘤转移相关性的研究正在不断深入中。

3.5 Serpin B9 与肿瘤治疗

化疗耐药、放疗抵抗以及免疫逃逸是肿瘤治疗失败的主要原因。局部晚期直肠癌研究发现，Serpin B9 的表达水平与术前新辅助化疗的应答效应呈负相关[46]。此外有研究发现，相较于没有微小残留灶的患者，遗留微小残留灶的儿童急性淋巴细胞白血病患者的Serpin B9 表达水平明显升高[47]。上述结果均提示，Serpin B9 高表达提示肿瘤耐药，但也有少数研究发现了不同的结果。为了评估Serpin B9 的作用，有研究构建了3 株Serpin B9 野生型稳定转染HeLa 细胞系和1 株表达无活性突变体Serpin B9 的细胞系，结果显示野生型细胞株中Serpin B9 高表达能够保护肿瘤细胞免于遭受NK 细胞介导的杀伤，但其表达对依托泊苷诱导的细胞凋亡没有影响[48]。总之，Serpin B9 参与肿瘤耐药，并在一定程度上提示存在高耐药性。

研究发现，放射剂量与Serpin B9 表达呈剂量依赖性负相关[49]，表明放疗可能使Serpin B9对肿瘤的保护作用降低。这项研究指出，放疗会削弱Serpin B9 的作用，但尚不清楚Serpin B9 高表达是否与肿瘤的放疗抵抗相关。除此之外，也有证据显示，肿瘤经电离辐射后，Ⅰ型干扰素可以通过调节Serpin B9 而保护肿瘤细胞免于受到T 细胞介导的细胞毒作用[50]。这项研究的结论与前一项研究的结论不一致，因此目前对于放疗与Serpin B9 之间的关系，仍需进一步探索。

在免疫治疗方面，目前已有研究证实Serpin可以引发肿瘤的免疫逃逸，导致免疫治疗失效，尤其是基于颗粒酶B 的疗法。食管癌和胃癌的相关研究发现，Serpin B9 表达下调可使NK 细胞被杀伤，最终导致NK 细胞免疫治疗失败[51]。

4 Serpin B9 与肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）

干细胞是指具有无限增殖、自我更新及多向分化能力的未分化细胞。研究发现，骨髓来源的间充质干细胞和胚胎干细胞均能高表达Serpin B9，从而保护其不被细胞毒性T 细胞释放的颗粒酶B所杀伤[52-53]，这一结果与之前的研究结果一致，即Serpin B9 能够保护正常干细胞而避免其发生凋亡。然而，目前有关Serpin B9 能否维持正常干细胞干性的研究却很少，因此Serpin B9 与CSCs 的相关研究或许能够提供一些启示。CSCs是肿瘤中具有极强的自我更新、多向分化和无限增殖能力的细胞，与肿瘤的发生、发展、转移和耐药均密切相关[54-55]。研究发现，具有高水平干性标记（Nanog、Oct3/4 和Sox2）和自我更新能力的乳腺癌干细胞表达较高水平的C-X-C基序趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）和磷酸化p38。CXCR4 是趋化因子基质细胞衍生因子1[又被称为C-X-C基序趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）] 的特异性受体，目前证实其能够维持CSCs 的干性，并参与CSCs 的趋化[56]。激活CXCR4/ 磷酸化p38 轴能够促进Serpin B9 高表达，干扰机体的免疫监视系统，保持乳腺癌干细胞的增殖和自我更新能力[57]。除干扰免疫系统以外，Serpin B9 还能够通过其他机制维持CSCs 的干性。HJELMELAND 等[58]研究发现，在酸性肿瘤微环境中，脑胶质细胞瘤中的缺氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）的表达水平明显上调，而Serpin B9作为HIF-2α 特异性靶基因，其在脑胶质干细胞中除了能够直接结合靶基因启动子以外，还可

5 总结与展望

Serpin B9 作为丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有调节机体炎症、补体、凝血和免疫等多种病理生理过程的作用，参与多种疾病的发生和发展，还能够抑制颗粒酶B 的杀伤作用，从而保护肿瘤细胞。目前的研究已证实，Serpin B9 能够减少肿瘤细胞凋亡，增强肿瘤的免疫逃逸，促进肿瘤的发生和转移以及肿瘤细胞的增殖，导致治疗失败。此外，临床研究发现Serpin B9 能够作为化疗和免疫治疗效果以及预后的预测指标。Serpin B9 可能成为肿瘤治疗的一个潜在的新靶点，但仍需进一步探索具体的机制。

越来越多的证据表明，CSCs 是肿瘤发生、发展、转移和耐药的主要负责细胞群。CSCs 的自我更新和无限增殖能力有助于肿瘤生长和维持。近年来的研究指出，Serpin B9 能够通过免疫逃逸保护CSCs 免于发生凋亡，并且参与维持CSCs 的干性，这是一项令人惊喜的发现。未来仍需要开展更多层面的研究，以深入阐明Serpin B9 在肿瘤和CSCs 中的作用及其可能的临床应用价值。