大蒜素抑制人胆囊癌NOZ细胞的增殖、侵袭并诱导其凋亡

李俊杰，邬海峰，张东明，张志平，陆赪阳，刘 波，李明章

胆囊癌起源于胆囊上皮细胞，是胆道系统中最常见的恶性肿瘤[1]。由于胆囊癌早期缺乏明显的症状和体征，并且早期易发生转移，因此大多数患者在确诊时已处于中晚期或不可治愈阶段，错过了最佳的早期治疗时机[2]。此外，胆囊癌对化疗不敏感，并且现阶段仍缺乏有效的靶向治疗和免疫治疗手段，而根治性手术切除是目前唯一有效的治疗方法。最新研究指出，2003—2015年胆囊癌5 年生存率持续下降，平均生存时间为5.2～24.4 个月[3-4]。因此，寻找有效且不良反应较小的抗胆囊癌药物对于胆囊癌的治疗以及改善胆囊癌患者的生活质量具有十分重要的意义。

大蒜素（allicin）是天然植物大蒜鳞茎的提取物，具有抗氧化、抗炎、抗细菌、抗真菌、免疫调节和心血管保护等功能[5]。现有研究已表明，大蒜素对原发性恶心肿瘤如胃癌、肝癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌和结肠癌等均具有抑癌作用[6-10]。国内已有研究报道大蒜素能够抑制人胆管癌细胞的增殖[11]，但尚未见有关大蒜素对胆囊癌细胞抑制作用的研究。本实验旨在检测大蒜素对胆囊癌细胞的增殖和侵袭是否具有抑制作用以及是否可以诱导胆囊癌细胞的凋亡，并且探讨其机制，以期为胆囊癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

胆囊癌细胞株NOZ 购于日本大阪健康科学研究资源库。胎牛血清、青霉素和链霉素双抗混合液购于美国Gibco 公司。孔径为8 μm 的聚酯透明膜Transwell 小室购于美国Corning 公司。William 细胞培养液购于吉诺生物医药技术有限公司。CCK-8 细胞计数试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的Annexin Ⅴ（AnnexinⅤ-FITC）/ 碘化丙 啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡试剂盒和细胞周期试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。兔抗人剪切型-聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（cleaved-polyadenosine diphosphate ribose polymerase，cleaved-PARP）、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、Bcl-2、Bax、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、细胞周期蛋白B1（cyclin B1）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）和GAPDH（内参照）单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG均购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。

酶联免疫检测仪为美国Molecular Devices 公司产品，倒置荧光显微镜为德国Leica 公司产品，-80 ℃超低温冰箱为日本三洋公司产品，化学发光仪为美国通用电气公司产品，流式细胞仪（Cyto FLEX）为美国贝克曼公司产品，SDS-PAGE 蛋白电泳仪和Bio-Rad 蛋白质转膜仪均为伯乐生命医学产品（上海）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

NOZ 细胞常规培养于含10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素混合液的William 全培养液中，并置于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养。当细胞融合度为70%～80%时进行传代培养，并选取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 CCK-8 法检测NOZ 细胞的增殖能力

将对数生长期的NOZ 细胞以2×103个/孔的密度接种于96 孔板中。培养12 h 待细胞贴壁后，将完全培养液更换为含有不同终质量浓度大蒜素（0、30、60、90 和120 μg/mL）的培养液，分别培养24、48 和72 h，每组设置3 个复孔，其中0 μg/mL 大蒜素组的NOZ 细胞仅用DMSO处理。加入CCK-8 试剂（10 µL/孔）避光继续孵育2 h，然后在酶联免疫检测仪波长450 nm 处检测各孔细胞D值，计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）-（药物组D值-空白对照组D值）/（对照组D值-空白对照组D值）×100%。采用Graphpad Prism 7 统计学软件计算大蒜素对NOZ细胞的半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC50），然后根据IC50值设置后续研究的药物浓度。

1.2.3 平板克隆形成实验检测NOZ 细胞的克隆形成和增殖能力

收集经不同质量浓度大蒜素（0、40、80 和120 μg/mL）处理48 h 后的NOZ 细胞，以500个/孔的密度接种于6 孔板中。每3 d 更换1 次完全培养液，培养15 d 后，除去培养液；用PBS溶液缓慢冲洗细胞2 次，加入4%多聚甲醛溶液固定细胞15 min 后，用0.1%结晶紫染色20 min。用清水缓慢冲洗掉残余染料，在室温下晾干，计数拍照。在光学显微镜下观察NOZ 细胞的克隆形成情况，计数＞30 个细胞的集落数量。

1.2.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI 双 染FCM 法检测NOZ 细胞凋亡率

NOZ 细胞的分组与处理方法同1.2.3 节。收集贴壁和悬浮的细胞，用预冷的PBS 溶液冲洗细胞2 次后，加入结合缓冲液重悬细胞；加入Annexin Ⅴ-FITC 和PI（具体剂量参阅试剂盒操作说明书），室温下避光孵育20 min，置于冰盒中，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 Hoechst 33342 染色法检测NOZ 细胞凋亡情况

取对数生长期的NOZ 细胞，接种于6 孔板中，孵育12 h 待细胞贴壁后，加入不同浓度的大蒜素（0、40、80 和120 μg/mL）继续处理48 h。收集细胞加入4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min，用PBS 溶液清洗细胞2 次，加入Hoechst 33342染色液，避光染色5 min。在荧光显微镜下观察NOZ 细胞的细胞核染色情况，计算核凋亡细胞所占百分比。

1.2.6 FCM 法检测NOZ 细胞周期分布的变化

收集经不同质量浓度大蒜素（0、40、80 和120 μg/mL）处理48 h 后的NOZ 细胞，用冰浴预冷的PBS 溶液洗涤，加入70%冰乙醇溶液固定细胞2 h 后，再次用预冷的PBS 溶液洗涤；收集NOZ 细胞，加入预先配制的PI 染色液，37 ℃避光孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.2.7 Transwell 小室实验检测细胞侵袭能力

将铺设有基质胶（matrigel）的Transwell 小室放入已加入600 μL 无血清培养液的24 孔板中，将小室置于细胞培养箱中水化2 h。收集NOZ 细胞（细胞的分组与处理同1.2.3 节），以2×104个/孔的密度接种于200 μL 无血清的培养液中，并且置于Transwell 小室的上层；在小室下层加入600 μL 含有10%胎牛血清的完全培养液作为趋化剂；24 h 后加入90%甲醛溶液固定细胞15 min，随后用棉签拭去小室上层未穿过小室膜的细胞；用结晶紫染色液染色15 min，清水缓慢清洗掉残余染料；在室温下晾干小室膜后，在光学显微镜下（放大倍数为100 倍）观察NOZ 细胞的形态，拍照计数。

1.2.8 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达量的变化

用不同质量浓度的大蒜素处理NOZ 细胞（细胞的分组与处理同1.2.3 节），48 h 后收集细胞。用RIPA 蛋白裂解液提取细胞总蛋白，随后用BCA 定量法计算蛋白质浓度。取20 μg/孔的蛋白样品，上样行10% SDS-PAGE 分离蛋白；采用湿转法将分离后的蛋白转移至PVDF 膜上；用含5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭40 min 后，分别加入一抗[ 兔抗人cleaved-PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin、vimentin 和GAPDH（内参蛋白）单克隆抗体（体积稀释比例均为1 ∶1 000）]4 ℃孵育过夜，随后用TBST 溶液摇床清洗3 次，10 min/次；加入二抗[辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（体积稀释比例均为1 ∶1 000）]室温孵育1 h 后，用TBST 溶液再次清洗3 次。采用电化学发光剂显影曝光后，检测蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参照GAPDH 蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.2.9 统计学方法

应用SPSS 22.0 统计学软件对数据进行统计学分析。所有实验均独立重复3 次，结果数据以表示。2 组间比较采用独立样本t检验；多组之间比较首先采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜素抑制人胆囊癌NOZ 细胞的增殖能力

用不同质量浓度的大蒜素（0、30、60、90和120 μg/mL）分别处 理NOZ 细 胞24、48 和72 h 后，采用CCK-8 法检测NOZ 细胞的增殖能力。结果（图1A）显示，随着大蒜素浓度的增加和处理时间的延长，NOZ 细胞的存活率逐渐降低（P均＜0.01）。这一结果表明，大蒜素可有效地抑制NOZ 细胞的增殖能力。大蒜素处理48 h 时，对NOZ 细胞的IC50值为（77.93±2.16）μg/mL。因此，后续选择大蒜素40 μg/mL 作为低浓度组，80 μg/mL 作为中浓度组，120 μg/mL 作为高浓度组。

平板克隆形成实验结果（图1B）显示，与对照组相比，随着大蒜素浓度的增加，NOZ 细胞的克隆形成数明显减少（P均＜0.001）。

上述结果说明，大蒜素可抑制胆囊癌NOZ细胞的增殖。

2.2 大蒜素促进人胆囊癌NOZ 细胞凋亡

FCM 法检测结果（图2A）显示，用不同质量浓度的大蒜素（0、40、80 和120 μg/mL）作用NOZ 细胞48 h 后，NOZ 细胞的存活率分别为（85.62±2.051）%、（73.57±3.468）%、（44.83±2.792）% 和（40.09±1.725）%，提示随着大蒜素浓度的增加，NOZ 细胞的存活率逐渐降低（P均＜0.01），而凋亡率（早期凋亡率与晚期凋亡率之和）逐渐升高（P均＜0.01）。

Hoechst 33342 染色法检测NOZ 细胞凋亡情况。结果（图2B）显示，用不同质量浓度的大蒜素（40、80 和120 μg/mL）作用NOZ 细胞48 h后，核凋亡细胞所占百分比分别为（6.69±1.13）%、（12.79±1.36）%和（38.21±2.80）%，细胞核发生固缩和碎裂的数量明显增加，与对照组[（2.08±0.70）%] 相比，差异有统计学意义（P均＜0.05）。

Fig.1 The proliferation of human gallbladder carcinoma NOZ cells treated with different concentrations of allicin (40,80 and 120 μg/mL) was detected by CCK-8 assay (A) and colony-formation assay (B).NOZ cells treated with DMSO were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).图1 分别采用CCK-8 法（A）和平板克隆形成实验（B）检测不同浓度大蒜素对NOZ 细胞增殖能力的影响

蛋白印迹法检测结果（图2C）显示，与对照组相比，大蒜素可上调促凋亡蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9 和Bax的表达水平（P均＜0.001），并且当大蒜素浓度为80 和120 μg/mL 时，可下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平（P＜0.001）。

上述结果均表明，大蒜素具有促进胆囊癌NOZ 细胞凋亡的作用。

2.3 大蒜素可将NOZ 细胞的细胞周期阻滞于G2/M 期

采用FCM 法检测大蒜素对NOZ 细胞周期的影响。FCM 法检测结果显示（图3A），随着大蒜素质量浓度的逐渐增高（40、80 和120 μg/mL），在G2/M 期细胞所占的百分比分别为（19.98±1.50）%、（30.13±1.44）% 和（37.52±0.96）%，与对照组的（9.07±1.27）%相比，分布于G2/M 期细胞所占的百分比明显提高，差异具有统计学意义（P均＜0.001）。

蛋白质印迹法检测结果（图3B）显示，与对照组相比，G2/M 期进展相关调节分子蛋白CDK1 和cyclin B1 的表达水平均明显下调（P均＜0.05）。

2.4 大蒜素抑制NOZ 细胞的侵袭能力

Transwell 小室实验检测结果显示（图4A），随着大蒜素质量浓度的增加（40、80 和120 μg/mL），NOZ 细胞穿过小室的细胞数分别为（306.30±28.73）个，（112.00±9.85）个 和（30.00±3.61）个，与对照组[（933.3±41.57）个]相比，穿过小室膜的细胞数明显减少，差异有统计学意义（P均＜0.001）。

Fig.2 The apoptosis of human gallbladder carcinoma NOZ cells treated with different concentrations of allicin (40,80 and 120 μg/mL) for 48 h was detected by flow cytometry (FCM) method (A) and Hoechst 33342,as well as the expression levels of apoptosis-related proteins cleaved-polyadenosine diphosphate ribose polymerase (cleaved-PARP),cleaved-caspase 3,cleaved-caspase 9,Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting (C).NOZ cells treated with DMSO were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).图2 分别采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染法（A）和Hoechst 33342 染色法（B）检测不同浓度的大蒜素作用48 h 后对胆囊癌NOZ 细胞凋亡的影响及蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达水平（C）

蛋白质印迹法检测结果（图4B）显示，经大蒜素处理后，NOZ 细胞中的侵袭抑制蛋白E-cadherin 的表达水平明显升高，而促运动及侵袭蛋白N-cadherin 和vimentin 的表达水平明显降低且呈剂量依赖效应（P均＜0.001）。

Fig.3 The cell cycle distribution of human gallbladder carcinoma NOZ cells treated with different concentrations of allicin (40,80 and 120 μg/mL) for 48 h was detected by flow cytometry (FCM) method(A),and the expression levels of cell cycle-related proteins cyclin B1 and cyclin-dependent kinase 1 (CDK1)were detected by Western blotting (B).NOZ cells treated with DMSO were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).图3 FMC 法检测不同浓度大蒜素对NOZ 细胞周期分布的影响（A），蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白的表达水平（B）

Fig.4 The invasion ability of human gallbladder carcinoma NOZ cells treated with different concentrations of allicin (40,80 and 120 μg/mL) for 48 h was detected by Transwell camber assay (A,crystal violet staining,×100),and the expression levels of invasion-related proteins E-cadherin,N-cadherin and vimentin were detected by Western blotting (B).NOZ cells treated with DMSO were taken as the control.***P＜0.001,vs the control group (n=3).图4 Transwell 小室实验检测大蒜素对NOZ 细胞侵袭能力的影响（A），蛋白质印迹法检测侵袭相关蛋白表达水平的变化（B）

3 讨论

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，其5年生存率仅为5%[12]。因此，新药研发对于胆囊癌的治疗具有重要意义。大蒜素为天然植物大蒜鳞茎的提取物，相关研究证明其对多种原发性肿瘤具有抑制作用。然而，有关大蒜素是否对胆囊癌亦具有抑制作用，尚未见相关报道。本研究旨在探讨大蒜素对胆囊癌NOZ 细胞的抑制作用及其机制。

本研究中，CCK-8 法和平板克隆形成实验结果显示，大蒜素可有效抑制胆囊癌NOZ 细胞的增殖能力。众所周知，细胞凋亡是诱导肿瘤细胞死亡的重要途径[13]。凋亡细胞可发生细胞核固缩、碎裂和溶解等一系列特殊的形态学变化[14]。本研究采用Annexin-V-FITC/PI 双染法和Hoehst 33342 染色法检测经大蒜素处理后NOZ 细胞的凋亡情况，结果显示细胞凋亡数明显增加，细胞核固缩和碎裂的比例也随大蒜素浓度的增加而逐渐升高，由此说明大蒜素可以促进胆囊癌细胞的凋亡。凋亡信号级联传导可通过死亡受体外途径和线粒体凋亡介导内途径发生[15]。定位于线粒体上的Bcl-2 家族蛋白包括促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，可调控线粒体中细胞色素的释放，从而激活caspase 级联产物及特定底物引起细胞发生凋亡[16-18]。本研究发现，大蒜素可明显上调Bax 的表达水平，同时降低Bcl-2 的表达水平，并且明显上调促凋亡蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9 的表达水平，说明大蒜素可能通过线粒体介导的细胞凋亡途径诱导胆囊癌NOZ 细胞发生凋亡。

由于肿瘤细胞具有快速增殖的特点，因此本研究检测了大蒜素对胆囊癌NOZ 细胞的细胞周期的影响。FCM 法检测结果显示，大蒜素可以将NOZ 细胞的细胞周期阻滞于G2/M 期。此外，细胞周期相关蛋白检测结果显示，CDK1 和cyclin B1 的表达水平均明显下调，而这2 种蛋白均是与G2/M 期进展相关的关键蛋白[19]。

本研究采用Transwell 小室实验证实大蒜素可以抑制NOZ 细胞的侵袭能力。E-cadherin 在维持细胞形态以及黏附系统中发挥重要作用，当黏附蛋白表达水平降低时，细胞的侵袭和迁移能力均明显增强[20]。N-cadherin 是非上皮性钙黏附蛋白之一，可以促进细胞的迁移和侵袭，其表达水平上调可增强细胞的侵袭能力[21]。Vimentin 的过度表达与肿瘤细胞侵袭能力增强以及不良预后均密切相关[22]。本研究发现，大蒜素可明显上调E-cadherin 的表达水平，从而增加细胞之间的黏附性，同时通过下调N-cadherin 和Vimentin 的表达水平，从而降低NOZ 细胞的侵袭能力。

综上所述，本研究结果提示大蒜素可明显抑制胆囊癌细胞的增殖和侵袭能力，并且促进胆囊癌细胞发生凋亡。本研究为大蒜素作为胆囊癌的潜在治疗药物提供了实验依据。本研究的不足之处在于仅进行了体外实验，今后将开展体内实验以进一步研究大蒜素对胆囊癌的作用及其机制。