原发性肝癌治疗中索拉非尼耐药发生机制的研究进展

陈华蕾，李威

中国原发性肝癌的发病率和病死率较高，发病数约占全球的46.71%，粗死亡率是全球的2.54倍[1]。2020年版《中国临床肿瘤学会（CSCO）原发性肝癌诊疗指南》为中晚期原发性肝癌患者推荐了多种全身治疗方案，其中靶向药物占据重要地位。索拉非尼的出现，开辟了肝癌靶向治疗的新时代。

索拉非尼是一种多激酶抑制剂，主要的作用靶点是酪氨酸激酶受体Flt-3、RET、血小板源性生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）α和β、血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）-1、-2和-3以及c-Kit等，发挥促进肿瘤细胞凋亡以及抑制血管生成和肿瘤细胞增殖的作用。然而，索拉非尼的客观缓解率较低，只能将生存期延长至数月，并且仅有30%的患者治疗有效，而且通常在6个月内出现耐药[2]。研究表明，索拉非尼的耐药机制包括表观遗传学改变、肿瘤微环境的缺氧、上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）、肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）活化、细胞凋亡、细胞周期失调和自噬等[3]。本文对原发性肝癌治疗中索拉非尼耐药发生机制的研究进展进行综述。

1 索拉非尼耐药产生的表观遗传学机制

表观遗传学修饰改变基因表达状态，对肿瘤细胞的形成和调节肿瘤细胞的增殖和分化均有重要作用。本文探讨非编码RNA和甲基化修饰与索拉非尼耐药的关系。

1.1 非编码RNA与索拉非尼耐药

非编码RNA主要包括miRNA、lncRNA、cirRNA、piRNA、snoRNA和snRNA等，非编码RNA不能转录形成蛋白质[4]，但可以调节细胞周期以及控制细胞的生长、发育、增殖和凋亡。部分非编码RNA还可以作为评估肿瘤患者预后的生物学标志物，与肿瘤的侵袭、转移和耐药有关[5]。目前，在众多的非编码RNA中，miRNA和lncRNA在索拉非尼耐药机制中扮演着十分重要的角色；近年来，cirRNA也渐受关注；而其他类型的非编码RNA与索拉非尼耐药的关系，尚未得到充分的验证。

1.1.1 miRNA

miRNA是由19～25个核苷酸组成的内源性小单链RNA，可以通过干扰原癌基因和抑癌基因的表达而导致肿瘤的发生[6-7]。miRNA参与原发性肝癌耐药的形成。

索拉非尼是中晚期原发性肝癌的标准治疗药物之一，其耐药对肝癌治疗具有重要意义[3]。部分miRNA的表达可以增加原发性肝癌对索拉非尼的耐药性，这主要与影响肿瘤细胞原癌基因或抑癌基因的表达，并且调节相关信号转导通路有关。其中，抑制抑癌基因PTEN的表达以及激活其下游PI3K/Akt信号通路较为常见。PI3K/Akt与Raf/MAPK/ERK是原发性肝癌发生中的关键性信号通路，2者之间通过共同的信号分子相互作用。索拉非尼主要抑制Raf/MAPK/ERK的激活，但miRNA介导的PI3K/Akt激活可以降低索拉非尼的疗效。miRNA-216a、217、494、622、21和552等可以通过上述机制参与索拉非尼耐药的形成[8-13]。mTOR通路的激活也与索拉非尼耐药有关。mTOR是Akt的下游分子，miR-21和miR-494可以激活Akt/mTOR/LC3和Beclin 1通路，进而影响肿瘤环境中自噬介导的索拉非尼耐药[10,13]。其他与索拉非尼耐药相关的信号通路还包括miR-216a/217上调癌基因SMAD7的表达，进而激活转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路[9]，miR-622激活RAF/ERK通路[11]、miR-181a抑制其下游信号通路RASSF1/MST2/PUMA[14]以及miR-126-3p通过下调SPRED进而激活ERK及其下游分子[15]等。一些肿瘤相关蛋白可以通过促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡以降低索拉非尼的敏感性，如miR-221下调细胞凋亡分子caspase-3的表达而抑制肿瘤细胞凋亡[16]，miR-223则可通过抑制FBW7使c-Jun、c-Myc和Notch-1蛋白表达增加，从而促进肿瘤细胞增殖[17]。近年来的研究发现，糖代谢异常参与索拉非尼耐药形成，miRNA可以作为该过程的中间桥梁。miR-21可使糖原合酶激酶3β磷酸化，进而抑制凋亡蛋白S6K与4EBP1结合而抑制肿瘤细胞凋亡[13]；miR-374上调可抑制hnRNPA1及其下游PKM2，减少糖酵解，引发索拉非尼耐药[18]。

研究表明，索拉非尼耐药还与部分miRNA下调有关。其中，miR-122备受关注。长期使用索拉非尼可使原发性肝癌细胞的miR-122表达下调，miR-122与胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor receptor type 1，IGF1R）表达呈负相关，IGF1R是肿瘤细胞的重要信号分子之一，在肿瘤的发生、抗肿瘤细胞凋亡以及抗肿瘤药物耐药中发挥重要作用。Akt是IGF1R关键的下游效应物，IGF1R活化可以进一步激活PI3K/Akt信号通路和Ras/Raf/MAPK通路，降低原发性肝癌细胞对索拉非尼的敏感性和治疗效应[19]。除此之外，miR-122下调所致的SerpinB3过表达，可使原发性肝癌对索拉非尼更具抗性[20]。miR-130-5p和miR-375表达下降可以分别激活CLCF1介导的PI3K/Akt通路以及索拉非尼-ASH1/miR-375/PDGFC通路以降低索拉非尼的效应[21-22]。低水平miRNA还可以通过调节肿瘤细胞相关蛋白降低索拉非尼的敏感性，如miR-27b和miR-193b作为细胞凋亡调节因子，分别沉默p53和（或）髓样白血病细胞分化蛋白基因以增强原发性肝癌细胞对索拉非尼的敏感性，因此低水平miR-27b和miR-193b可能会降低索拉非尼的效应[3]。血清外泌体中的miRNA-744可以增加PAX2的表达，参与肿瘤细胞增殖和索拉非尼耐药[23]，而miR-140-3p与miRNA-744的作用机制相似[24]。还有研究表明，一些miRNA的高表达可以增加索拉非尼的敏感性，如miR-541、miR-486-3p、miR-23b-3p和miR-194等，这些miRNA均有望为解决索拉非尼的耐药性提供新的靶点[25-28]。

针对索拉非尼耐药的原发性肝癌，抑制耐药相关上调的miRNA或阻断其诱导的信号通路，可能会增加索拉非尼的效应。同样地，外源性补充耐药相关下调的miRNA，也可以增强索拉非尼治疗的敏感性。上述2种治疗思路已在细胞研究和动物实验中得以证实。

目前关于miRNA与索拉非尼耐药的机制研究，主要是通过采用生物信息技术和患者的组织样本，找出可能相关的miRNA，并将其应用于细胞研究和动物实验，而尚未发现相关的临床研究。即便如此，大量的基础研究为后续的临床研究奠定了基础，以miRNA为靶点，克服索拉非尼耐药性的研究有望为原发性肝癌的治疗策略提供新的方向。

1.1.2 lncRNA

通过对肿瘤基因组图谱和数据库进行分析以及对病理组织标本进行检测，探讨lncRNA在原发性肝癌索拉非尼耐药中的作用。lncRNA长度超过200个核苷酸，可以与miRNA相互作用，调节相关信号转导通路，共同参与索拉非尼的耐药性。lncRNA SNHG1通过SLC3A2激活Akt信号通路，使其作用于下游的GSK-3β和mTOR，诱导肿瘤细胞增殖及抑制其凋亡，参与索拉非尼耐药性的形成[29]。在原发性肝癌中，lncRNA SNHG3可以调节miRNA-128/CD151途径，激活PI3K/Akt信号通路，进而诱导EMT和索拉非尼耐药性的形成[30]。对原发性肝癌患者的组织标本进行检测，发现肿瘤组织中DANCR过表达，并且与原发性肝癌患者的预后相关。相关细胞研究的结果显示，lncRNA DANCR可以激活原发性肝癌细胞中IL-6/STAT3通路而参与耐药的形成[31]。FOXD2-AS1在索拉非尼耐药的原发性肝癌细胞中的表达下降，进而促进miR-150-5p降 解TMEM9 mRNA，OXD2-AS1和TMEM9表达下调与索拉非尼耐药性呈正相关，因此lncRNA FOXD2-AS1通过FOXD2-AS1/miRNA-150-5p/TMEM9/Nrf2信号通路参与耐药[32]。目前，对lncRNA NEAT1的研究颇受关注。一方面，lncRNA NEAT1表达上调可以抑制miR-204表达水平，进而促进ATG3的表达，增强原发性肝癌细胞自噬，影响索拉非尼的疗效；另一方面，lncRNA NEAT1可使miR-335表达下调，并且介导c-Met-Akt通路激活，降低原发性肝癌对索拉非尼的敏感性[33-34]。除lncRNA通过miRNA调节信号转导以外，lncRNA H19和lncRNA TTN-AS1等可以通过影响原发性肝癌的上皮间质转化和细胞周期而参与耐药性的形成[35-36]。一些动物实验通过对lncRNA进行基因敲除以增强索拉非尼的敏感性，但缺乏相关的临床研究。以lncRNA为靶点克服索拉非尼的耐药性是未来的重要研究方向之一。

1.1.3 circRNA

既往的索拉非尼耐药研究主要聚焦于miRNA和lncRNA。最新的研究发现，在索拉非尼耐药的原发性肝癌细胞中，circRNA表达发生显著改变，并且差异表达的circRNA可能参与索拉非尼耐药和肿瘤进展[37]。circRNA-SORE可与细胞质中的YBX1结合，阻止YBX1与E3泛素连接酶Prp19相互作用，抑制PRP19介导的YBX1降解，从而降低疗效反应。此外，circRNA-SORE可以经由外泌体在原发性肝癌细胞之间传播，使耐药的原发性肝癌细胞的数量增加[38]。靶向circRNASORE或YBX1为克服索拉非尼耐药奠定了基础。此外，circRNA-SORE能够隔离miRNA-103a-2-5p和miRNA-660-3p，从而竞争性激活Wnt/β-catenin途径，并诱导耐药。针对这一机制，circRNA有望成为原发性肝癌的新治疗靶点[39]。目前，对cirRNA与索拉非尼耐药的研究尚处于起步阶段，还缺乏充足的基础研究证据。

1.2 甲基化修饰与索拉非尼耐药

异常甲基化可改变基因表达并诱导肿瘤发生。研究证实，MORC2-NF2/KIBRA轴是维持索拉非尼耐药的关键环节。肿瘤细胞中的MORC2可以识别并结合NF2和KIBRA启动子DNA上的甲基转移酶DNMT3A，发生甲基化修饰，从而维持索拉非尼的耐药性[40]。m6A可修饰调节mRNA的稳定性，并且参与剪接和翻译。METTL3是主要的m6A甲基转移酶，FOXO3是其重要的下游分子。肿瘤微环境中的m6A通过YTHDF1依赖机制增强FOXO3 mRNA 3’-非翻译区的修饰稳定性，最终导致并维持索拉非尼的耐药性[41]。m6A RNA甲基化还可以降低HNF3γ的表达，使肝癌细胞去分化，降低索拉非尼的疗效。相关研究表明，原发性肝癌中METTL14依赖性m6A甲基化可以介导HNF3γ表达下降，HNF3γ在肿瘤分化和索拉非尼耐药中发挥重要作用，其表达下调可使原发性肝癌细胞对索拉非尼的敏感性下降。因此，HNF3γ有望成为索拉非尼治疗靶点和疗效预测指标[42]。m6A修饰的circRNA-SORE可以通过调节β-catenin信号通路以维持索拉非尼的耐药性[39]。由此看来，原发性肝癌相关基因的甲基化水平可以影响索拉非尼的疗效，应进一步开展相应的基础研究和临床试验。

2 索拉非尼耐药的药物运输机制

索拉非尼在肿瘤细胞之间的运输会影响其抗肿瘤效应。肿瘤细胞之间主要通过ATP结合盒转运蛋白和外泌体囊泡实现药物运输。

2.1 ATP结合盒转运蛋白

ATP结合盒转运蛋白属于膜内在蛋白质超家族，能够水解ATP释放能量，并且供各种分子实现跨膜转运，将药物从肿瘤细胞中排出，从而减弱药物的疗效[43]。索拉非尼等多种激酶抑制剂均可与ATP结合盒转运蛋白相互作用。一些ATP结合盒转运蛋白的拮抗剂可以为对抗索拉非尼耐药开辟新的途径[44]。研究证实，β-石竹烯氧化物可以抑制ATP结合盒转运蛋白，并且改善原发性肝癌细胞对非毒性剂量索拉非尼的疗效；此外，β-石竹烯氧化物还可以抑制索拉非尼的降解，促进药物在肿瘤细胞内积聚，增强细胞毒性反应[45]。在HepG2/S原发性肝癌细胞中，索拉非尼的耐药性还与CSN5基因有关。CSN5基因沉默可下调多种耐药相关蛋白（ATP结合盒转运蛋白B1、ATP结合盒转运蛋白2和ATP结合盒转运蛋白G2）的表达，进而增强索拉非尼的疗效[46]。

2.2 外泌体囊泡

外泌体是包含复杂RNA和蛋白质的小膜泡，直径为40～100 nm。外泌体有助于肿瘤细胞之间的信息传递，并且参与肿瘤细胞的侵袭和转移，还是引发索拉非尼耐药的重要环节[47-48]。来自原发性肝癌细胞的外泌体表达特异性标志物CD9和CD63可以通过激活HGF/c-Met/Akt信号通路，抑制索拉非尼诱导的细胞凋亡，进而使肿瘤细胞对索拉非尼产生耐药性[49]。研究显示，siGRP78修饰的外泌体靶向原发性肝癌细胞中的GRP78，进而抑制原发性肝癌细胞的生长和侵袭，逆转荷瘤小鼠对索拉非尼的耐药性[50]。动物实验表明，使用肿瘤细胞的外泌体（DC-TEX）对树突状细胞进行脉冲处理，并将其与索拉非尼和程序性死亡受体1（programmed cell death proten-1，PD-1）抑制剂联用，能够增强索拉非尼在原发性肝癌模型中的疗效[51]。目前，研究人员已尝试将外泌体作为治疗靶点，其中包括使用外泌体负载治疗药物，如功能蛋白、lncRNA和化疗药物等，为提高索拉非尼的敏感性提供新的方向。

3 肿瘤微环境与索拉非尼耐药性的产生

肿瘤微环境是指肿瘤的发生、生长及转移的环境，主要由肿瘤细胞和非肿瘤细胞（肿瘤相关免疫细胞如巨噬细胞、骨髓源抑制细胞、肿瘤相关中性粒细胞、癌症相关成纤维细胞和调节性T细胞）构成。在肿瘤微环境中，肿瘤基质和肿瘤细胞可产生炎症因子（如生长因子、细胞因子和趋化因子）参与肿瘤相关免疫抑制作用，帮助肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。肿瘤微环境与索拉非尼耐药性的形成有一定关联，以下将进行展开说明[52]。

3.1 缺氧

在原发性肝癌的发生和发展过程中，缺氧通过激活缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）和VEGF以促进肿瘤血管生成，索拉非尼的抗血管生成作用源于阻断HIF/VEGF途径[53-54]。持续使用索拉非尼可以上调HIF-1α或HIF-2α的表达，促进线粒体吞噬、细胞增殖、葡萄糖代谢、血管生成、肿瘤侵袭和转移等基因的转录，并且激活相应的信号转导通路，如HIF-1α介导的糖代谢和细胞自噬等途径以及NF-κb通路；HIF-2α介导的TGF-α/EGFR和pSTAT3/pAKT/pERK途径，可引发索拉非尼耐药。此外，耐受缺氧和营养不足的肿瘤细胞的存活和积累限制了索拉非尼的疗效[55]。目前，可以通过抑制HIF及其相关信号转导通路以克服索拉非尼的耐药性，如抑制COX/PGE2轴以调节HIF-2α的表达[56]，或使用二甲双胍调节HIF-2α和TIP30的表达以增强原发性肝癌细胞对索拉非尼的敏感性[57]。ADRB2对维持肝癌细胞的增殖和存活十分重要，ADRB2信号通路可负性调控细胞自噬，进而使HIF-1α稳定性增加，并且通过调节肝癌细胞的葡萄糖代谢等，从而促进索拉非尼耐药[58]。

3.2 免疫因素

免疫逃逸在肿瘤的发生、发展和耐药中的作用日益受到关注，为肿瘤治疗提供了新的方向。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）通过表达细胞因子和趋化因子以抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤进展[59]。动物研究发现，持续使用索拉非尼可导致肿瘤微环境中TAM数量增加[60]。索拉非尼耐药的原发性肝癌患者体内的M2型TAM数量显著增加。M2型TAM可以分泌肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），通过激活肿瘤细胞中的HGF/c-Met、ERK1/2/MAPK和PI3K/AKT通路以维持肿瘤细胞的生长和转移，并且增强索拉非尼的耐药性。除此之外，HGF对周围的巨噬细胞具有趋化作用，并且通过反馈作用增强索拉非尼的耐药性[61]。

肿瘤相关炎症反应是近年来的研究热点之一。肿瘤微环境中的肿瘤相关中性粒细胞（tumorassociated neutrophil，TAN）可以通过分泌促炎因子和血管生成因子以及免疫调节等，促进肿瘤的发生和发展[62]。TAN分泌的CCL2和CCL17是影响肿瘤进展和预后的重要因素。一方面，CCL2可以募集巨噬细胞浸润肿瘤组织；另一方面，CCL17对Treg细胞具有诱导募集作用。TAN介导的肿瘤巨噬细胞和Treg细胞的募集可以刺激新生血管形成，从而促进原发性肝癌的生长和转移，对索拉非尼产生耐药性。因此，TAN的浸润程度可以作为预测原发性肝癌对索拉非尼效应的生物学标志物，而耗竭TAN可以增强索拉非尼的疗效[63]。

除此之外，索拉非尼可以通过影响Akt和ERK1/2磷酸化，抑制自然杀伤细胞的增殖和反应性，减弱自然杀伤细胞的抗肿瘤效应，参与索拉非尼耐药的形成[64]。SHI等[51]发现，索拉非尼治疗的原发性肝癌小鼠的肿瘤组织中，Treg细胞的数量和程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表达上调。树突状细胞可使CD8+T细胞数量增多，并且减少Terg细胞的数量。PD-1抗体可以在不改变Treg细胞数量的基础上恢复CD8+T细胞的数量。根据既往研究的结果，外泌体可以作为治疗药物的载体（如功能蛋白、ncRNA以及化疗药物等），改善原发性肝癌治疗过程中的耐药性，因此树突状细胞与外泌体联合PD-1抑制剂有望增强索拉非尼的疗效[51]。免疫微环境是肿瘤发生和治疗的研究热点，需要开展更多研究以探索单药治疗或联合治疗提高索拉非尼治疗敏感性的方式。

4 病毒感染与索拉非尼耐药性

乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染是中国原发性肝癌发生的主要原因。研究表明，肝炎病毒感染与索拉非尼耐药性有关。乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白是一种多功能蛋白，主要调节病毒的复制，显著影响肝细胞的信号传导、新陈代谢、凋亡、细胞因子的产生、细胞周期的调控以及癌基因和抑癌基因的表达，干扰线粒体氧化磷酸化等能量代谢过程，导致细胞氧化损伤，促进细胞凋亡。乙型肝炎病毒的DNA可以随机整合入宿主基因，尤其是乙型肝炎病毒X蛋白C末端，促进肝癌发生的同时，抑制凋亡级联反应如STAT3/Nanog通路，使原发性肝癌细胞对索拉非尼产生抗药性[65]。研究发现，PMAPK14（与索拉非尼耐药相关的一种蛋白激酶）磷酸化与乙型肝炎病毒X蛋白表达相关，抑制pMAPK14的表达可以增强索拉非尼的疗效，改善HBV相关原发性肝癌患者对索拉非尼的耐药性，因此，pMAPK抑制剂联合索拉非尼有望提高HBV相关原发性肝癌对索拉非尼的敏感性[66]。WU等[67]发现，乙型肝炎病毒相关原发性肝癌中，HNF4α表达明显下降，并且与miRNA-122启动子的结合减弱，由此抑制miRNA-122基因的表达，上调GALNT10（与miRNA-122表达呈负相关）的表达，进而诱导索拉非尼耐药性的产生，因此调节miRNA的表达有望成为增强乙型肝炎病毒相关原发性肝癌对索拉非尼反应的潜在方法。目前，病毒感染与索拉非尼耐药性的关系尚未阐明，今后需要在确保安全性和有效性的基础上，开展相关的临床研究。

5 其他机制

自噬是真核生物中细胞内物质周转的重要过程，不仅参与肿瘤的发生和发展，同时是在治疗和代谢应激的情况下，原发性肝癌对索拉非尼等抗血管生成药物产生耐药性的重要机制[68]。因此，如何通过改变自噬水平来控制索拉非尼耐药性的产生以及提高索拉非尼的疗效，已成为关注的焦点之一。铁死亡是一种非凋亡性调节性细胞死亡过程，主要由铁离子或铁酶催化的细胞中脂质氧化物的代谢异常所致。铁死亡产生过量的脂质过氧化产物，发生氧化应激，从而引发细胞死亡。索拉非尼可诱导铁死亡的发生，从而导致耐药性的形成[69]。除此之外，最近的研究表明，肿瘤干细胞也与原发性肝癌的索拉非尼耐药有关，PTK2活化Wnt/β-catenin信号转导，进而激活肿瘤干细胞的特性是其可能的作用机制[70]。

6 讨论

索拉非尼是晚期原发性肝癌常用的全身治疗药物，但其耐药性限制了疗效。目前，临床上除改用其他一线或二线治疗以外，可以通过联合细胞毒药物以及其他靶向药物以提高敏感性。近年来，免疫治疗的出现为原发性肝癌的治疗提供了新的方向。免疫检查点抑制剂联合靶向治疗成为潜在的治疗手段。

当前针对索拉非尼的耐药机制应开展进一步的研究，综合生物信息技术、组织病理学检查、细胞实验和动物实验等，从分子生物学、药物运输以及病毒感染等多个领域，探索新的治疗靶点，以提高原发性肝癌对索拉非尼的敏感性。