血清外泌体vWF含量及活性对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后的影响

叶芬，张淑贤，菅成莲，孙娴婷，许壁榆, ，肖菲，黄洪晖，侯健，王婷

非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin’s lymphoma，NHL）是起源于淋巴细胞或淋巴组织的一组血液系统恶性肿瘤，根据2018年全球癌症数据统计，NHL在男、女恶性肿瘤发病率中分别位于第8和第10位[1]。而弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）则是发病率最高的B细胞NHL，占所有NHL的30%～35%[2]。DLBCL是一类高度异质性疾病，其基因表达谱和基因改变存在差异，从而导致患者的临床病程和对治疗的反应产生显著差异[3]。虽然随着利妥昔单抗免疫治疗及诸多靶向新药的应用，DLBCL的治疗疗效有一定改善，但仍有30%～40%的患者存在原发耐药、疾病进展或复发现象，DLBCL仍然是一个重要的临床挑战[4-5]。因此，对DLBCL这种异质性进行风险分层分析就变得越来越重要，因为它可能导致针对不同的患者群体选择不同的靶向治疗。1993年起，国际预后指数（international prognostic index，IPI）评分在临床上被用于侵袭性NHL患者的预后风险分层[6]。2014年，ZHOU等[7]利用美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）中的数据，通过细化年龄和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）分类，建立了改良的国际预后指数NCCN-IPI，以改进NHL患者的风险分层。然而，尽管诊断标准不断进展，处于同一危险组的患者仍表现出异质性结局，这表明现有的用于DLBCL的预后因素在区分具有高危特征的患者时并不理想。因此，将IPI与其他分子标志物结合可能进一步提高其预后价值。

外泌体（exosomes）是一种可以被大多数细胞分泌的，直径为30～150 nm的细胞外囊泡；外泌体被脂质双层包裹，存在于多种类型的细胞外液中，包括血液、尿液、羊水、唾液、脑脊髓液、甚至母乳[8]。携带各种生物分子，包括蛋白质、脂质、代谢产物和核酸[9]。外泌体稳定存在于大多数人体体液中，是理想的液体活检样本，其内容物可作为预测患者预后的标志物[10-11]。血液中外泌体蛋白或核酸谱的改变与包括癌症在内的许多疾病的病理过程相关。然而，以往外泌体在癌症诊断和治疗中的应用研究主要集中在微RNA（microRNA，miRNA）上，随着外泌体内容物的快速规模化提取、纯化和筛选的发展，有望探索外泌体蛋白在早期癌症诊断、监测和预后评估中的应用[12]。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）是一种复杂的多聚体糖蛋白，在原发性止血过程中起关键作用[13]。许多研究报道vWF与炎性反应、血管生成和肿瘤转移有关[14]。有研究显示，vWF可以介导胃癌细胞聚集并与血小板和内皮细胞相互作用，从而促进肿瘤转移[15]；vWF还可与生长因子结合，促进伤口部位的血管形成，从而在调节血管生成方面发挥重要作用[16]。还有研究显示，vWF以严格依赖血小板和血小板糖蛋白GPIb的方式促进白细胞从血管外渗[17]。现已有一些关于实体瘤患者血浆vWF含量与预后关系的研究，但尚未有关于血清外泌体vWF的研究。本研究拟通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫比浊法检测外泌体中vWF含量和活性，分析其与DLBCL患者预后的相关性，以期能更好的预测DLBCL患者的预后并提高其危险分层能力。

1 资料和方法

1.1 细胞株、主要试剂和仪器

人DLBCL细胞SU-DHL-4由本实验室常规保存培养。RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自以色列BI公司。外泌体分离试剂盒Total Exosome Isolation Reagent（from serum）购自美国Thermo Fisher公司（货号：4478360）。3%钼酸铵负染色液购自北京索莱宝科技有限公司，300目碳覆膜铜网和反向自锁镊子购自上海百枢光电科技有限公司。鼠抗人CD63单克隆抗体和兔抗人Calnexin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人CD9单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司（货号：13174），兔抗人肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）多克隆抗体购自美国Proteintech公司（货号：14497-1-AP），兔抗人vWF单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司（货号：65707S），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠IgG（二抗）（货号：ab6789）购自英国Abcam公司，HRP标记的羊抗兔IgG（二抗）（货号：7074）购自美国Cell Signaling公司。预染蛋白marker（货号：26616）购自美国Thermo Fisher科技公司。RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDSPAGE凝胶配制试剂盒和蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司。蛋白酶体抑制剂（货号：539131）和PVDF膜购自美国Millipore公司。化学发光显色液购自苏州新赛美生物技术有限公司。人Von Willebrand Factor ELISA试剂盒（货号：ab108918）购自英国Abcam公司。免疫组织化学检测试剂盒和DAB显色剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）（型号：HT7700）为日本HITACHI公司产品，纳米粒径分析仪（型号：Zetasizer Nano S）为英国Malvern公司产品，蛋白电泳槽及转膜装置为美国Bio Rad公司产品。

1.2 病例收集及随访

选取38例2012年1月—2017年6月由上海交通大学医学院附属仁济医院血液科收治的，确诊为DLBCL患者的临床资料。其中，男性26例，女性12例，患者中位年龄61.5岁（范围：26～86岁），按Ann Arbor分期标准，Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期8例，Ⅳ期8例。收集各患者治疗前的外周血清样本，－80 ℃保存。患者应用免疫化疗治疗原发病，且收样前未接受任何抗肿瘤治疗。本研究获得上海交通大学医学院附属仁济医院医学伦理委员会审查通过，所有患者均已签署知情同意书。纳入标准：（1）患者年龄≥18岁；（2）经病理学确诊为DLBCL；（3）保存有足够量的血清。排除标准：（1）患者年龄＜18岁；（2）原发性中枢神经系统DLBCL；（3）合并其他恶性肿瘤。

所有患者均通过电话、电子病历或辅助检查等方式进行随访，随访截止日期为2018年7月，其中失访4例，随访率为89.47%，中位随访时间为28.59个月（范围：6.33～75.57个月）。

1.3 血清外泌体的分离提取

取100 μL血清样本通过2 000×g离心30 min，去除细胞及细胞碎片，将含有澄清血清的上清液转移到新的试管中，然后加入其1/5体积的Total Exosome Isolation（from serum）试剂，将血清与试剂充分混匀后置于4 ℃条件下孵育30 min，然后在室温条件下10 000×g离心10 min，外泌体沉淀在管底，除去上清液，用PBS重悬沉淀，即为分离获得的外泌体。

1.4 蛋白质印迹法鉴定外泌体标志蛋白

使用100 μL含有1 mmol/L蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液冰上裂解100 μL外泌体和1×107个SU-DHL-4细胞，4 ℃ 10 000×g离心15 min，收集上清液。采用BCA法测定总蛋白浓度。取30 μg蛋白样品用10% SDS-PAGE分离蛋白，并将分离后的蛋白在100 V恒压条件下转移到PVDF膜上。将蛋白膜用含5%脱脂牛奶常温封闭1 h，然后分别加入一抗 [兔抗人CD9和Calnexin单克隆抗体、鼠抗人CD63单克隆抗体和兔抗人TSG101多克隆抗体（体积稀释比例均为1∶1 000）]，4 ℃孵育过夜。在摇床上用TBST清洗3次，每次10 min。加入相应种属的二抗[HRP标记的羊抗鼠IgG（体积稀释比例为1∶5 000）或羊抗兔IgG（体积稀释比例为1∶2 000）]室温孵育1 h，TBST清洗3次后，用电化学发光显色剂显影，Tanon 5200全自动化学发光成像分析系统成像。

1.5 透射电子显微镜检测外泌体形态和大小

适当稀释外泌体溶液，取10 μL稀释后的外泌体样本滴于300目碳覆膜铜网上，静置1 min，用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴10 μL的3%钼酸铵于铜网上负染1 min后，滤纸从边缘吸去多余的染液，滴一滴纯水于铜网上，立即用滤纸从边缘吸去多余的液体，重复3次，室温晾干（约10 min），100 kV在透射电子显微镜下观察并拍照。

1.6 纳米粒径分析仪检测外泌体粒径分布

取40 μL血清，提取外泌体后（流程同1.3节），用加入3 mL PBS重悬外泌体，混匀；将3 mL外泌体溶液加入与纳米粒径分析仪Zetasizer Nano S仪器配套的标准比色皿中，上机，利用动态光散射来检测外泌体的粒径分布范围。

1.7 ELISA法检测血清及血清外泌体中vWF的含量

采用人Von Willebrand Factor ELISA试剂盒检测血清及血清外泌体中vWF的含量，按操作手册准备所有试剂、工作标准液和样品，平衡至室温（18～25 ℃）。

制备样品：取2 μL血清，使用1×稀释液将血清稀释至600 μL。取40 μL血清提取外泌体（流程同1.3节），加入40 μL PBS重悬外泌体，取2 μL外泌体样品，用1×稀释液稀释至200 μL。

向每个孔中加入vWF标准液或上述制备获得的样品（50 μL），轻轻拍打培养板以彻底覆盖孔，用密封胶带盖住培养板并孵育2 h；用PBS洗涤后，每个孔中加入50 μL生物素化的vWF抗体，轻轻拍打板以彻底覆盖孔，除去气泡并孵育2 h；用PBS洗涤培养板后；向每个孔中添加50 μL链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）偶联物，孵育30 min；如上述方法清洗培养板；向每个孔中添加50 μL色原底物，并在环境光下孵育约20 min，直到形成最佳的蓝色密度；向每个孔中添加50 μL终止溶液，颜色将从蓝色变为黄色；立即在酶标仪上读取波长为450 nm和570 nm的D值，用450 nm处减去570 nm处的读数以矫正光学缺陷；使用ElisaCalc软件绘制标准曲线，最佳拟合线通过使用四参数对数曲线拟合的回归分析来确定，并计算各样品的浓度。

1.8 免疫比浊法检测血清外泌体vWF的活性

从50 μL血清中提取外泌体（流程同1.3节），用1×PBS稀释至600 μL，使用美国贝克曼TOP-700全自动血凝仪，按照说明书上机操作，应用免疫比浊法检测血清外泌体vWF的活性。

1.9 免疫组织化学法检测淋巴瘤组织中vWF的含量

各选取3例分期为I期或Ⅲ＋Ⅳ期的DLBCL患者的石蜡标本（共6例），使用病理切片机切片（切片厚度为3 μm），依次将切片放入二甲苯溶液→无水乙醇→85%乙醇溶液→75%乙醇溶液中脱蜡至水，再用蒸馏水冲洗。随后组织切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液（pH值＝6.0）中于微波炉内进行抗原修复，切勿干片。自然冷却后将切片置于PBS（pH值＝7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片放入3%双氧水溶液中，室温避光孵育25 min，PBS洗涤切片。在组化圈内滴加含3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均匀覆盖组织，室温封闭30 min。在切片上滴加一抗[兔抗人vWF单克隆抗体（体积稀释比例为1∶500）]，4 ℃孵育过夜。PBS洗涤切片。在圈内滴加HRP标记的羊抗兔IgG（二抗）覆盖组织，室温孵育50 min。PBS洗涤切片。在圈内滴加DAB显色液，光学显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染3 min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入75%乙醇溶液→85%乙醇溶液→无水乙醇溶液Ⅰ→无水乙醇溶液Ⅱ→二甲苯溶液Ⅰ中脱水透明，稍晾干，中性树胶封固。倒置光学显微镜下检测染色情况，采集图像，使用Image J软件对图片进行分析。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 8和SPSS 21.0软件对研究数据进行统计学处理和分析。所有实验均独立重复3次，定量资料以表示。2组间的差异采用Mann-Whitney检验和非配对t检验。基于log-rank检验的Kaplan-Meier法进行生存分析，利用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线计算曲线下面积（area under the curve，AUC）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清外泌体的特征

使用蛋白质印迹法检测外泌体标志蛋白的存在，通过透射电子显微镜和纳米粒径分析仪来验证血清外泌体的形态特征和大小分布。蛋白质印迹法检测结果（图1A）显示，血清外泌体均表达外泌体特异性标记蛋白CD63、CD9和TSG101，且不表达细胞内容物钙连蛋白Calnexin；反之，淋巴瘤细胞株SU-DHL-4细胞缺乏CD63、CD9和TSG101的表达，但表达Calnexin。

透射电子显微镜下观察结果（图1B）提示，分离出的外泌体呈典型的茶托样结构，直径为50～100 nm。纳米粒径分析仪下检测结果（图1C）显示，外泌体的直径约为30～150 nm。

上述结果表明，本研究用于外泌体分离的方法是可靠的，获得的外泌体可用于后续研究。

Fig.1 Characterization of serum-derived exosomes.The expression of exosomal biomarker CD63,CD9 and tumor susceptibility gene 101 (TSG101),as well as cell content Calnexin on diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL) patients (3 cases) and lymphoma SU-DHL-4 cells were detected by Western blotting (A),and the morphology and size of exosomes were examined by transmission electron microscopy (B) and the size distribution range of exosomes was measured by Zetasizer Nano S (C).图1 蛋白质印迹法检测DLBCL患者（3例）和淋巴瘤SU-DHL-4细胞上外泌体标志蛋白CD63、CD9和TSG101以及细胞内容物Calnexin的表达情况（A），并分别采用透射电子显微镜检测外泌体的形态和大小（B）以及纳米粒径分析仪Zetasizer Nano S检测外泌体的粒径分布范围（C）

2.2 血清vWF含量与DLBCL患者临床特征及预后的相关性

38例DLBCL患者的临床特征见表1。其中Ⅰ＋Ⅱ期者22例（57.89%），Ⅲ＋Ⅳ期者16例（42.11%）；IPI评分为0～2分者28例（73.68%），3～5分者10例（26.32%）。使用ELISA法检测各患者血清中vWF的含量，根据血清vWF含量的中位值（10.2μg/mL）将38例DLBCL患者分为＜10.2μg/mL和≥10.2μg/mL组，每组各19例患者。结果显示，血清vWF含量与患者的分期有关，Ⅰ＋Ⅱ期者血清vWF含量为（8.547±4.476）μg/mL，Ⅲ＋Ⅳ期者血清vWF含量为（15.980±11.570）μg/mL，提示分期越晚血清vWF含量越高（P＝0.016 3）（图2A）；但血清vWF含量与患者的IPI评分（P＝0.061 2）（图2B）及总生存（overall survival，OS）率（P＝0.141 9）（图2C）和无进展生存（progression-free survival，PFS）率（P＝0.053 6）（图2D）均无关。

2.3 血清外泌体中vWF含量与DLBCL患者临床特征及预后的相关性

ELISA法检测38例DLBCL患者血清外泌体中vWF含量，患者的临床病理特征见表1。结果显示，Ⅰ＋Ⅱ期组患者血清外泌体vWF含量为（6.813±2.799）μg/mL，Ⅲ＋Ⅳ期组患者为（16.770±11.610）μg/mL；与Ⅰ＋Ⅱ期组患者相比，分期越晚（Ⅲ＋Ⅳ期），患者血清外泌体vWF含量越高（Mann-Whitney检验，P＝0.000 8）（图3A）。IPI评分低（0～2）组患者血清外泌体中vWF含量为（8.268±5.577）μg/mL，IPI评分高（3～5）组患者为（18.670±12.780）μg/mL；与IPI评 分低组相比，IPI评分越高血清外泌体vWF含量也越高（P＝0.004 9）（图3B）。根据血清外泌体vWF含量的中位值（8.6μg/mL）将DLBCL患者分为＜8.6 μg/mL及≥8.6 μg/mL组，每组各19例患者。Kaplan-Meier生存分析显示，血清外泌体vWF含量高的DLBCL患者，其OS率（P＝0.003 8，图3C）和PFS率（P＜0.000 1，图3D）均低于vWF含量低的患者。上述结果提示，血清外泌体中vWF含量与患者的分期、IPI评分及预后均相关。

表1 DLBCL患者的临床病理特征Table 1 Clinicopathological features of 38 patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)Total＝38,n/%

Fig.2 The association between the level of serum von Willebrand factor (vWF) and Ann Arbor stage (A),international prognostic index (IPI) score (B),overall survival (OS) rate (C),and progression-free survival(PFS) rate (D) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients.图2 血清vWF含量与DLBCL患者分期（A）、IPI评分（B）、OS率（C）和PFS率（D）之间的相关性

Fig.3 The association between the level of serum exosomal von Willebrand factor (vWF) and Ann Arbor stage (A),international prognostic index (IPI) score (B),overall survival (OS) rate (C),and progression-free survival (PFS) rate (D) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients.图3 血清外泌体中vWF含量与DLBCL患者分期（A）、IPI评分（B）、OS率（C）和PFS率（D）之间的相关性

2.4 血清外泌体vWF活性与DLBCL患者临床特征及预后的相关性

采用免疫比浊法检测38例DLBCL患者血清外泌体中vWF的活性，患者的临床病理特征见表1。结果显示，Ⅰ＋Ⅱ期组患者血清外泌体vWF活性为（4.26±5.19）%，Ⅲ＋Ⅳ期组患者为（12.18±10.51）%，与Ⅰ＋Ⅱ期组患者相比，分期越晚（Ⅲ＋Ⅳ期）患者血清外泌体vWF活性越高（P＝0.017 6）（图4A）。IPI评分低（0～2）组患者血清外泌体vWF活性为（4.68±5.36）%，IPI评分高（3～5）组患者为（15.76±11.17）%；与IPI评分低（0～2）组相比，IPI评分越高（3～5），血清外泌体vWF活性也越高（P＝0.006 9）（图4B）。根据血清外泌体vWF活性的中位值（4.85%）将DLBCL患者分为＜4.8%和≥4.8%组，每组各19例患者。Kaplan-Meier法生存分析显示，血清外泌体vWF活性高的DLBCL患者，其OS率（P＝0.038 7，图4C）和PFS率（P＝0.007 6，图4D）均明显低于vWF活性低的患者。上述结果提示，血清外泌体vWF活性与患者的分期、IPI评分及预后均具有相关性。

Fig.4 The association between serum exosomal von Willebrand factor (vWF) activity and Ann Arbor stage (A),international prognostic index (IPI) score (B),overall survival (OS) rate (C),and progression-free survival (PFS) rate (D) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients.图4 血清外泌体vWF活性与DLBCL患者分期（A）、IPI评分（B）、OS率（C）和PFS率（D）之间的相关性

2.5 血清外泌体vWF含量及活性对DLBCL患者预后的预测价值

ROC分析结果（图5）显示，血清外泌体中vWF含量及活性对DLBCL患者OS的预测价值高，AUC分别为0.773 9（P＝0.014 1）和0.731 8（P＝0.037 8），且与IPI的预测能力相当（AUC＝0.800 8，P＝0.007 0）；而血清外泌体vWF含量及活性对DLBCL患者PFS的预测价值更高，AUC分别为0.923 1（P＜0.000 1）与0.820 0（P＝0.001 4），且血清外泌体vWF含量对DLBCL患者PFS的预测能力要优于IPI（AUC＝0.841 5，P＝0.000 6）。

Fig.5 Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis of serum exosomal von Willebrand factor(vWF) level,serum exosomal vWF activity and international prognostic index (IPI) on overall survival (OS)(A) and progression-free survival (PFS) (B) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients图5 ROC法验证血清外泌体vWF含量、活性和IPI评分对DLBCL患者OS及PFS的预测价值

2.6 淋巴瘤组织中vWF的表达水平

选取6例DLBCL患者（Ⅰ期和Ⅲ＋Ⅳ期各3例），采用免疫组织化学法检测患者肿瘤组织中vWF的表达量。结果（图6）显示，Ⅲ～Ⅳ期患者肿瘤组织中vWF的表达量明显高于Ⅰ期患者（P＝0.002 4）；这一结果提示，分期越晚，DLBCL患者肿瘤组织中vWF表达呈升高趋势。在光学显微镜下观察发现，淋巴瘤组织中vWF主要表达在内皮细胞中，而在肿瘤细胞中未见有表达。

Fig.6 The expression level of von Willebrand factor (vWF) in tumor tissues of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients with different stages were detected by immunohistochemistry (DAB staining,×200).图6 免疫组织化学法检测不同分期DLBCL患者肿瘤组织中vWF的表达水平

3 讨论

静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）是癌症患者死亡的一个主要原因[18]。淋巴瘤患者发生VTE的风险增加，然而对于这种潜在的遗传性或获得性血栓形成倾向的原因目前仍然知之甚少[19]。一项对1 038例侵袭性及惰性NHL和霍奇金病患者的研究发现，其中有8%的患者发生了血栓栓塞事件[20]。恶性肿瘤或化疗可引起的内皮细胞、促凝细胞因子和血小板活化，而遗传和获得性血栓形成因子都与恶性疾病患者血栓栓塞的发病机制有关[21]。血浆vWF抗原水平升高与VTE风险升高相关[22]。vWF作为凝血因子Ⅷ的伴侣蛋白，可将其传递到损伤部位，稳定凝血因子Ⅷ的异二聚体结构，并保护其在血浆中不被过早清除。已有研究显示，血浆vWF含量及活性在淋巴瘤患者中升高，并与凝血因子Ⅷ的含量具有相关性[19]。然而，目前尚没有血浆vWF含量与淋巴瘤患者预后的相关研究报道。本课题组前期专注于研究血清外泌体与DLBCL患者预后的相关性，通过蛋白质组学研究发现血清外泌体vWF是与DLBCL患者预后有关的一种危险因素，因此本研究采用ELISA法检测血清中vWF的表达量，结果发现血清vWF含量与DLBCL患者的分期相关，分期越晚，血清vWF含量越高。这与在其他肿瘤的研究结果相一致，vWF水平已被证明在多种实体瘤中显著升高，并与肿瘤的大小和分级有关[23]。有研究显示，高水平的血浆vWF在结直肠癌[24]、肺癌[25]、卵巢癌[26]和恶性胶质瘤[27]中与患者更差的预后相关。本研究结果显示，血清vWF含量高的DLBCL患者，其OS及PFS率明显低于血清vWF含量低的患者，但差异无统计学意义。这可能是由于本研究的样本量较少的缘故，未来仍需要扩大样本量进一步予以检测分析。

由于外泌体体积小，穿透组织屏障能力强，广泛存在于多种体液中，因此临床检测较便捷[12]。此外，外泌体的脂质双层膜结构使其内容物在血液循环中不能被细胞外的蛋白酶降解，具有高度的稳定性，可长期保存[28]。另外，由于血液成分的复杂性，血清中存在的高丰度蛋白使得部分低丰度蛋白很难检测到，而这部分低丰度蛋白很可能是潜在的生物标志物，分离提取血清中的外泌体可以有效去除大部分血清高丰度蛋白，并显著降低体液的复杂性，从而有助于癌症早期筛查潜在生物标志物的低丰度蛋白[12,28]。相较于血清，外泌体提供了一个更纯净的不含血浆蛋白的生物样本，从而使生物标志物的分析和验证更加容易。对外泌体的分析是开发用于监测癌症的新型蛋白质生物标志物的一种途径，外泌体蛋白正在成为癌症监测和疗效评估的极具前景的临床预后工具。例如，外泌体磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1，GPC1）可能作为一种潜在的非侵入性诊断和筛查工具来检测早期胰腺癌，从而及时进行根治性手术治疗[29]；血清细胞外囊泡富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）和富含亮氨酸的α-2糖蛋白1（leucine rich alpha-2 glycoprotein 1，LRG1）可能是结肠癌诊断和预后的生物标志物[30]；腹腔积液来源的外泌体中高糖基化CD133可作为晚期胰腺癌患者预后的潜在生物标志物[31]；外泌体碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）可以通过核因子-κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）和信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路促进化疗耐药，并可作为DLBCL患者预后的生物标志物[32]。目前尚无外泌体vWF蛋白与肿瘤预后的相关性研究。本研究首次探讨了DLBCL患者血清vWF含量、血清外泌体vWF含量及活性对DLBCL患者预后的影响。结果显示，血清vWF含量仅与患者的分期有关，而血清外泌体vWF含量及活性则与患者的分期、IPI评分及预后均显著相关，对于患者的OS与PFS具有较好的预测价值，可以作为DLBCL患者的预后生物标志物。该结果也进一步证实，相较于血清，血清外泌体蛋白可作为一种更有潜力的预后标志物。

越来越多的证据表明，血管生成和内皮细胞激活在实体肿瘤和恶性血液肿瘤的发病和进展中起着重要作用[33-35]。在多种恶性肿瘤患者中发现，骨髓血管密度和血管生成因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）浓度升高。HUSSONG等[36]通过观察20例急性髓系白血病患者的骨髓血管密度和对vWF染色后发现，与正常对照组相比，肿瘤患者中血管生成增加。NEGAARD等[37]分析了93例血液恶性肿瘤患者的骨髓血管密度以及一系列血管生成因子，结果表明骨髓血管生成在多发性骨髓瘤和NHL的发病和进展中起着重要作用。vWF作为血管内皮细胞的分子标志物，在体内仅在内皮细胞和巨核细胞中合成[38]。在巨核细胞和其产生的血小板中，vWF储存在α颗粒中。内皮细胞合成的vWF，则既可以直接分泌到血浆中，也可以储存在内皮细胞的细胞器中，因此称之为Weibel-Palade bodies（WPB）。已有研究显示，不同病理亚型NHL的微血管密度随其恶性度的增高而逐渐升高[39]。本研究中采用免疫组织化学法检测了6例DLBCL患者肿瘤组织中vWF蛋白的表达，结果发现分期晚的DLBCL患者肿瘤组织中血管内皮细胞的vWF表达量高于分期早的DLBCL患者，提示分期晚的DLBCL患者肿瘤组织的血管生成增多，但仍需进一步分析淋巴瘤组织中的微血管密度予以确认，由于样本量较少，该结果还有待扩大样本量进行验证。

综上所诉，血清外泌体vWF含量及活性，与DLBCL患者的分期及IPI评分存在相关性，并能显著区分患者的OS与PFS，可作为DLBCL的一种潜在预后标志物。相较于血清vWF，血清外泌体vWF具有更好的临床预后价值，ELISA及免疫比浊法检测的实现也为其临床应用提供了便利。