C-Myc在多发性骨髓瘤中的研究进展

杨 宁，钟 华

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种浆细胞恶性增殖性疾病，其特点为克隆性浆细胞在骨髓中异常增殖。MM发病率在血液系统肿瘤中排第2位，约占血液系统肿瘤的13%[1]。尽管近年来多种新的治疗药物包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物和单克隆抑制剂等在临床上得到了应用，使患者的整体生存状态得到了明显改善，但该疾病从本质上讲仍属于不可治愈性疾病。因此，深入探究MM的分子遗传改变对于MM的早期诊断与提供新的治疗靶标具有重要意义。Myc是一种原癌基因，其家族有3个成员，C-Myc、N-Myc和L-Myc，分别位于人染色体8q24、2p24和1p34上[2]。当C-Myc作为转录因子时，其又属于碱性螺旋环螺旋亮氨酸拉链（basic helix loop helix leucine zipper，bHLH-Zip）家族，在多数情况下，C-Myc主要通过C端bHLHZIP与同样含bHLH-ZIP结构的C-Myc关联因子X（C-Mycassociated factor X，MAX）形成异聚体，C-Myc与MAX异二聚体能特异性识别和结合靶基因DNA序列中的CACGTG核心序列E盒基序（enhancer box，E-Box），调节靶基因转录[3]；因此，C-Myc可以调节许多生物学功能，包括影响细胞生长和增殖功能的复制、转录和翻译，以及细胞代谢和凋亡；提示C-Myc可能是癌症治疗的潜在靶标。有相关研究表明，从癌前病变单克隆丙种球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）发展为冒烟型骨髓瘤（smoldering myeloma，SMM），进而发展为有症状的MM，C-Myc的表达增强是上述病程进展的关键机制之一[4]。有研究者提出了MM发病机制是免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain，IgH）与C-Myc基因共同作用的二次打击学说。C-Myc的异常高表达不仅被认为是MGUS向MM转变的信号，也是影响晚期疾病进展的关键因素[5]。了解和探究C-Myc在MM发生和发展中的作用，对于探究MM的发病机制及开发新型治疗策略具有重要的指导意义。因此，本文将就近几年来MM中C-Myc的相关研究进展作一综述。

1 C-Myc基因在肿瘤细胞中的功能

1.1 C-Myc激活DNA复制

C-Myc可以直接调控DNA复制，导致基因组不稳定和DNA损伤。C-Myc可于哺乳动物细胞DNA合成的早期调节DNA复制起点的活性。C-Myc的过表达能导致细胞周期S期的DNA合成位点数量增加，继而引起活化复制子数量的增加。这可能与肿瘤发生过程中会发生的基因组改变如非整倍性，多中心染色体和染色体断裂有关[6]。

1.2 C-Myc调控细胞转录

已有研究表明，C-Myc编码的核磷蛋白与MAX结合成异二聚体时可以起转录激活剂的作用，但当其与MAX二聚体蛋白（MAX dimerization protein，MXD）家族转录因子结合时又转变为抑制转录作用[7]。C-Myc调控转录有2种模式：染色质侵犯和选择性调节。染色质侵犯是指，C-Myc作为基因转录的通用放大器，作用于所有活化的基因启动子和增强子，此时，高表达的C-Myc不会结合和调节特定靶基因的表达，而是会放大细胞内所有基因的转录。选择性调节是指，C-Myc可以直接上调或下调某一个或一类基因的表达[2]。C-Myc调控细胞转录具体包括6个方面：（1）C-Myc调节剪接因子。C-Myc可直接调控剪接体组件的转录，如核小糖核蛋白颗粒的装配组件核不均一核糖核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNPA1）和hnRNPA2、多聚嘧啶结合蛋白（polypyrimidine tract-binding protein，PTB）和蛋白质精氨酸甲基转移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）等剪接因子，从而影响细胞转录。如丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PKM）在这些剪接因子作用下会产生2个可变剪接的产物，有利于氧化磷酸化的PKM1和有利于有氧糖酵解的PKM2。C-Myc可上调PTB、hnRNPA1和hnRNPA2的转录水平，导致PKM的剪接变体PKM2表达水平增高。高PKM2/PKM1比值将有利于有氧糖酵解，这将促进肿瘤的进展[8]。（2）C-Myc激活核糖体合成和蛋白质合成。C-Myc与核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）启动子中的E-Box元件结合，募集转录活化结构域相关蛋白来诱导rRNA的转录。C-Myc驱动的肿瘤也依赖蛋白质翻译活动，真核起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）结合蛋白1（eIF4E-binding protein 1，EIF4EBP1）通过与eIF4E结合来阻止翻译起始。在一种C-Myc驱动的转基因小鼠模型中，C-Myc基因过表达导致哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）依赖的EIF4EBP1过度磷酸化，从而失去了与eIF4E结合的活性，并促进了肿瘤的存活[9]。（3）C-Myc调控细胞周期。C-Myc可通过多种机制促进细胞进入S期。大多数细胞周期关键调节因子都是由C-Myc调控的基因编码，这些C-Myc的靶基因包括细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）、细胞周期蛋白和E2F转录因子等。细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）可以编码p21。细胞S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein 2，Skp2）是一种参与p27降解的蛋白质。C-Myc通过阻断CDKN1A的转录或诱导Skp2的表达来拮抗细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p27的作用。此外，C-Myc还可以诱导p27降解所必需的枯灵素1（cullin 1，CUL1）的转录，从而促进细胞进入S期[10]。（4）C-Myc调控细胞代谢。C-Myc通过调节参与糖酵解和谷氨酰胺代谢的多个基因的转录，如葡萄糖膜转运蛋白1（glucose membrane transporter 1，GLUT1）和丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运载体2（alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2），从而调控细胞代谢[11]。（5）C-Myc参与哺乳动物细胞凋亡。逃避C-Myc基因驱动的细胞凋亡的常见机制是抗细胞凋亡相关因子B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的激活。在扩增或易位而导致C-Myc过度表达的肿瘤中，也有研究报道了Bcl-2基因座的各种重排[12]。有研究显示骨形态蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）可能通过核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路引起C-Myc表达下调，从而使MM细胞凋亡[13]。（6）C-Myc和免疫微环境相互作用。通常情况下肿瘤的发生和发展需要逃避免疫监视。免疫抑制分子的过度表达，如程序性死亡-配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）代表了癌症中免疫逃避的关键机制。免疫调节分化簇蛋白47（cluster of differentiation 47，CD47）可 与PD-L1结 合 从而引起细胞凋亡。C-Myc可直接结合这2种免疫检查点的启动子以调节肿瘤细胞表面CD47和PD-L1的表达[14]。

2 MM中C-Myc基因过表达的机制

C-Myc过表达在MM的发生和发展中起着关键的作用，目前认为MM中C-Myc过表达的机制有以5种：（1）染色体易位。涉及C-Myc异常表达的染色体易位情况在新诊断的MM患者中占20%～50%，这些易位涉及免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）基因位点和一些非Ig融合伴侣基因，如46序列相似的家庭成员C（family with sequence similarity 46，member C，FAM46C）、叉头转录因子O亚型3（forkhead box O3，FOXO3）和骨形态发生蛋白6（bone morphogenetic protein 6，BMP6）。融合基因是指将2个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列和终止子等）控制之下，构成的嵌合基因，参与融合的基因称为融合伴侣基因。在这种情况下，在融合伴侣基因的增强子或超级增强子的作用下，C-Myc基因启动子的活性增强从而引起C-Myc过表达[15]。（2）染色体8q24.21位点重复。在15%的新诊断MM患者中存在8q24.21位点重复和C-Myc基因扩增，其中38%的患者还存在C-Myc基因的易位，62%的患者仅存在局灶性染色体增加[16]。（3）大鼠肉瘤病毒癌（ratsarcoma viral oncogene，RAS）基 因 突 变。N-RAS和K-RAS是MM中2种最常见的突变基因，RAS信号通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）使C-Myc第62位丝氨酸（Ser62）磷酸化，Ser62磷酸化可以增强C-Myc的稳定性。基因表达分析的结果表明，几乎所有发生RAS基因突变的MM患者均存在C-Myc基因高表达的特征。大多数情况下，在RAS基因突变的患者中未发现IgH易位，这表明RAS基因突变可能直接参与了C-Myc的激活[17]。（4）C-Myc与干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）的反馈调控。IRF4是MM中反复突变的基因之一，IRF4可直接结合C-Myc启动子区域，增加C-Myc的表达。在MM细胞中，IRF4与C-Myc形成正反馈通路，从而进一步增加C-Myc的表达[18]。（5）果蝇3号姐妹染色单体分离缺陷突变3（defective in sister chromatid disjoining 3，DIS3）基 因/LIN-28同源 基 因B（LIN-28 homolog B，LIN28B）/微RNA（microRNA，miRNA）let-7/C-Myc信 号转导轴。DIS3因最早在果蝇中发现而得名，其编码的蛋白DIS3亚基是保守的RNA核酸酶及外泌体的催化亚基，属于RNaseⅡ3’-5’核酸外切酶超家族，其能够对所有的RNA进行加工或者促使其降解。该蛋白氨基端含有PIN结构域，赋予DIS3核酸内切酶活性，羧基端具有RNB结构域，赋予其3’-5’核酸外切酶活性。LIN28B编码的蛋白是一种RNA结合蛋白，可调节miRNA let-7的表达。LIN28B蛋白与let-7的5’-非编码区结合，激活RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），从而抑制C-Myc的表达。DIS3失活会增加LIN28B的表达，抑制let-7的表达，从而导致C-Myc的过度表达[19]。

3 C-Myc基因过表达与MM发生和发展的相关性

已有大量临床数据显示，MGUS是MM的癌前病变，几乎所有的MM患者都经历了从癌前病变MGUS到MM的过程，MGUS患者中每年有1%进展为MM患者[20]。因此，探究MGUS到MM这一过程中的分子驱动因素对于MM的预防和治疗都显得尤为重要。在一种C-Myc驱动的MM转基因小鼠模型中，首先证实了C-Myc基因在MGUS向MM发展的过程中发挥的驱动作用[21]。此外，基因集富集分析显示了C-Myc在MM中表达增强，而在MGUS中几乎不表达，由此提示MYC高表达是导致MM疾病进展的中心事件之一。CHNG等[22]采用基因富集分析比较了Affymetrix U133平台上22例MGUS和101例MM患者的基因表达数据集，发现C-Myc在67%的MM中高表达，但在MGUS中没有高表达。同时又对48例MM（新诊断36例和复发12例）骨髓样本和8例MGUS骨髓样本采用免疫组织化学法检测浆细胞表面蛋白CD138和细胞核中C-Myc蛋白的表达水平，结果显示在MGUS样本中未检测到C-Myc高表达，但在60%的MM样本中检测到C-Myc高表达。XIAO等[23]通过对26例MM骨髓样本和29例MGUS骨髓样本进行免疫组织化学检测，结果发现84%的MM样本中有C-Myc表达，而MGUS的样本中没有一例有C-Myc表达。在一项涉及23例患者的研究中概述了骨髓瘤的克隆进化过程及存在的细胞遗传学异常，结果发现23例患者中有12例出现或进展为浆细胞白血病（plasma cell leukemia，PCL）和（或）髓外疾病（extramedullary disease，EMD）。所有患者中位总生存（overall survival，OS）期为20.2个月，PCL或EMD患者的OS期分别为15.5和40.4个月，均有明显缩短（P＝0.000 5）；由此提示，任何类型的Myc基因高表达对于MM患者的生存都是不利的，即使是Myc基因低倍数扩增的MM患者，其肿瘤也趋于晚期且预后不良。C-Myc的过度表达也与更具侵袭性的MM相关，如PCL和EMD[24]。有研究提示，继发性PCL是终末期MM的白血病转化，这可能与Myc的过度表达有关[25]。大量的临床研究表明，C-Myc高表达意味着MM的进展和（或）预后不良。XIAO等[23]发现，在接受蛋白酶体抑制剂硼替佐米和SCT治疗的MM患者中，通过11个月的中位随访期发现，中高表达与低表达C-Myc基因的患者之间，24个月无进展生存（progressionfree survival，PFS）期率分别为40%与86%，24个月OS率分别为63%与100%，这表明C-Myc基因的表达水平与以硼替佐米为主的MM临床治疗反应性之间呈负相关。SZABO等[26]对117例MM患者的回顾性研究中发现，在40%的患者中C-Myc呈过表达，C-Myc的过表达与高钙血症（P＝0.02）和EMD（P＜0.01）有关，也与较短的OS期相关[风险比（hazard ratio，HR）＝1.92，P＝0.03]。在一项对214例SMM骨髓样本的全外显子测序中发现，C-Myc基因畸变（易位或扩增）的患者中位进展时间（time to progression，TTP）最短（8.4～51.6个月，P＜0.001），诊断时C-Myc基因畸变与较高的骨髓浸润相关（P＜0.001）并且C-Myc基因是进展的独立风险预测因子[27]。MØLLER等[28]对194例未经治疗的新诊断的MM骨髓样本采用免疫组织化学法同时检测CD138和C-Myc蛋白的表达情况；研究结果显示，C-Myc蛋白阳性表达率≥40%（C-MycHigh）患者的平均OS期为11个月，而C-Myc蛋白阳性表达率＜40%（C-MycLow）患者的中位生存期为48个月（P＜0.01）。C-MycHigh与国际分期系统（revised international staging system，R-ISS）、高增殖指数、骨髓中浆细胞比例、成浆细胞形态、高血钙水平和异常核型均显著相关。C-MycHigh是影响OS的独立风险因子（HR＝2.5）。

4 MM中C-Myc基因相关治疗靶点的研究进展

目前，在MM治疗中，已经开发出了有几种直接或者间接靶向C-Myc的新治疗方法，其中一些治疗措施已经开始在临床试验中进行评估。

4.1 靶向抑制C-Myc基因的转录

具体有以下几种方法：（1）通过siRNA靶向抑制C-Myc基因的表达。DCR（dynamic contrast ratio，Dicer，又 称DCR）是RNAaseⅢ家族中的一员，其主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体，形成siRNA；切割产生的siRNA片断解开变成单链与体内某些蛋白质形成RISC。RISC能结合到细胞内与siRNA互补的mRNA上，并切割该mRNA，使其被降解，造成蛋白质无法合成，继而产生基因“沉默”现象。通过包裹在脂质纳米颗粒中靶向C-Myc基因的siRNA，可以实现对C-Myc基因表达的直接抑制。这种脂质纳米颗粒被称为DCR-C-Myc，可以抑制C-Myc基因的翻译和表达[29]。一项Ⅰ期临床试验（NCT02110563）正在评估DCRC-Myc对实体瘤、MM或淋巴瘤患者的安全性和耐受性，相关结果还未进行报道。（2）靶向抑制C-Myc-MAX结合。目前研发出的小分子抑制剂10058-F4或10074-G5，在体外实验中显示出具有抑制C-Myc与MAX形成异二聚体的活性。然而，这些分子在体内的快速降解和较差的体内分布阻碍了其进一步发挥应有的作用[30]。抑制C-Myc与MAX结合的新分子Mycro3在小鼠胰腺导管腺癌模型上显示出较好的治疗作用，在MM中的作用还需要进一步的验证。因此Mycro3也是C-Myc基因驱动的MM的潜在用药[31]。（3）免疫调节药物。在过去20年中，免疫调节药物沙利度胺和来那度胺等的应用显著改善了MM患者的预后。Ikaros家族锌指蛋白1（Ikaros family zinc finger proteins 1，IKZF1）和Ikaros家 族锌指蛋白3（Ikaros family zinc finger proteins 3，IKZF3）是B细胞分化过程中转录调控网络必不可少的的转录因子，来那度胺通过诱导蛋白酶体中IKZF3的泛素化降解，降低了IRF4的表达，参与到C-Myc的正反馈回路，从而降低C-Myc的表达[32]。（4）靶向抑制剪接体功能。C-Myc基因驱动的肿瘤细胞具有核心剪接体依赖性。在一项对C-Myc基因驱动的三阴性乳腺癌的全基因组测序中，鉴定出了SF3B1、U2AF1、SNRPF、EFTUD2和BUD31等5个剪接体成分，研究中发现在体内扰乱剪接体的功能可以杀死小鼠模型中的肿瘤细胞，同时并不影响正常细胞。敲低BUD31或SF3B1，或使用SF3B1的抑制剂SD6分子，可以减少乳腺癌原发肿瘤的肿瘤细胞数量，并且抑制异种移植瘤的形成[33]。这些结果表明，靶向剪接体干预为C-Myc驱动癌症的治疗提供了机会。（5）溴结构域蛋白质抑制剂。人类溴结构域蛋白质家族的溴结构域蛋白2（bromodomain containing protein 2，BRD2）、溴结构域蛋白3（bromodomain containing protein 3，BRD3）、溴结构域蛋白4（bromodomain containing protein 4，BRD4）的溴结构域和末端结构域（bromodomain and extraterminal，BET）能识别乙酰化赖氨酸残基的蛋白结构域，这种识别是一些调节蛋白和组蛋白的结合以及染色质结构重塑的先决条件。如BET能识别组蛋白拖尾上N末端的赖氨酸残基，从而导致染色质结构的变化，调节靶基因的表达。BRDs在超级增强子中募集转录中介体亚基1（mediator subunit 1，MED1），并通过与正性转录延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）和RNA聚合酶Ⅱ的相互作用促进基因转录。C-Myc基因本身的转录也受BET溴结构域的调控。针对BRD的同类最优小分子抑制剂OTX015已经在编号为NCT01713582的Ⅰ期临床试验中确定了淋巴瘤和MM患者的最大耐受剂量[34]。在编号为NCT02157636包括复发性MM在内的Ⅰ期临床试验中，小分子抑制剂CPI-0610显示出了潜在的临床前活性[35]。

4.2 抑制C-Myc基因的翻译

C-Myc基因的翻译高度依赖真核翻译起始因子4F（eukaryotic translation initiation factor 4F，eIF4F）。eIF4F复合物由eIF4E、eIF4A和eIF4G亚基组成，其中eIF4E可被eIF4E结合蛋白（eIF4E binding protein 1，4E-BP1）结合，而阻止翻译起始。由mTOR信号转导的4E-BP1的过度磷酸化导致eIF4E被4E-BP1释放，使eIF4F复合物形成，进而C-Myc基因翻译开始。C-Myc基因本身也可激活eIF4E的表达，构成反馈回路。当mTOR信号被磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）激活时可抑制C-Myc的翻译。磷酸肌醇3-激酶δ（phosphoinositide 3-kinase delta，P13Kδ）是丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）的一种亚型，主要存在于免疫细胞和血液细胞中。研究表明，新型PI3Kδ同种抑制剂TGR-1202可破坏4E-BP1-eIF4F-MYC轴，从而对B细胞和T细胞淋巴瘤、白血病、MM的细胞系和原代细胞具有抗肿瘤作用[36]。一项复发或难治性淋巴瘤患者的Ⅰ/Ⅱ期研究（NCT02867618）正在评估TGR-1202和卡非佐米的联合用药效果。

4.3 抑制C-Myc基因与肿瘤免疫微环境的相互作用

C-Myc基因可直接结合CD47和PD-L1基因启动子调节细胞表面CD47和PD-L1的表达，从而利于肿瘤生长。免疫检查点抑制剂可能成为治疗MM的新靶点。NCT02678338、NCT02953782、NCT02216409和NCT02953509等临床试验正在评估抗PD-L1的单克隆抗体atezolizumab和durvalumab的治疗效果[37]。此外，探究PD-L1抑制剂与其他药物的联合使用也是目前MM治疗的热点。有研究报道，在复发难治性多发性骨髓瘤（relapsed and refractory multiple myeloma，RRMM）患者中，接受抗程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death 1，PD-1）的单克隆抗体pembrolizumab＋来那度胺或泊马度胺＋地塞米松治疗后，总缓解率（overall response rate，ORR）约为50%～60%，但这种联合用药的安全性问题尚待解决[38]。

5 总结与展望

C-Myc作为MM发生和发展过程中起重要作用的原癌基因，应受到足够的重视。尽管大量基础研究已经证实了其在调节多种细胞生物功能中所发挥的作用，但目前对C-Myc基因驱动MGUS向MM的进展机制及针对C-Myc基因所进行的相关靶向治疗仍处在起步阶段。深入探究其结构、作用机制和对在MM发生和发展过程中发挥的具体作用，研究和开发以此为靶点的新型靶向药物将对MM的发病机制、早期检测和疾病预后具有重要意义。