电针对T2DM胰岛素抵抗大鼠肝脏血清酶学及AMPK、GLUT4表达的影响*

李秋艳，李 瑞，段浩茹，庄舒婷，郭孟玮

(北京中医药大学，北京 100029)

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种慢性血脂代谢异常疾病，病理基础以胰岛素缺乏和胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)为主，由遗传和环境等多因素共同引起[1]。糖尿病总人数的90%以上为2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)。“葡萄糖仓库”肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官，是葡萄糖代谢及其他各种代谢的重要场所[2]。加强改善肝脏功能、增强肝脏细胞膜表面的受体活性及改善肝部损伤可显著调节胰岛素分泌和胰岛素抵抗[3]。AST、ALT主要由肝细胞分泌，当肝细胞损伤时，胞膜表面通透性改变，使胞浆内ALT、AST释放到血液中[4]，血清AST、ALT的升高水平与肝细胞受损水平呈正比关系。ALT水平能更敏感地感知肝脏是否受到损伤，其水平程度反应了胰岛素抵抗程度[5]。肝细胞中另一项酶学指标GGT与ALT相比，GGT比ALT更好地预测早期糖尿病的发生[6]。AMPK作为细胞能量的感受器，它的激活可调控肝糖原合成、葡萄糖和脂肪酸等相关能量代谢通路[7],亦可调控GLUT4的表达和转位，促进肝糖原的摄取。

目前国内对糖尿病并发症如心血管疾病、肾病、脑及视神经损伤研究较为广泛，但对肝脏相关疾病方面的研究较少，所以本课题组采取建立2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型的方法，研究电针对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠状态的影响以及肝细胞中转氨酶水平、AMPK和GLUT4的变化，重点从肝脏组织角度为针刺治疗胰岛素抵抗的研究提供理论基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

实验动物为SPF级ZDF大鼠16只与ZL大鼠8只，北京维通利华公司提供，动物饲养于23 ℃、空气流通、相对湿度50%～70%和12 h昼夜循环光照的条件下。先普通饲料适应性饲养1周，此期间动物自由饮食水。适应性饲养结束后开始4周诱导饲养，在诱导饲养及实验干预周期中，所有动物均用Purina #5008饲料喂养。

1.2 饲料与仪器

罗氏血糖仪(ACCU-CHEK Performa，罗氏血糖健康医护公司);罗氏血糖试纸(罗氏血糖健康医护公司);0.22 mm×13 mm无菌针灸针(北京中研太和医疗器械有限公司);电针仪;大鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006];Purina#5008饲料(美国PMI营养国际有限责任公司，粗脂肪≥7.0%，粗蛋白质≥23.5%，粗纤维≤4.0%)。

2 实验方法

2.1 大鼠模型的建立

ZDF大鼠以高糖高脂Purina#5008饲料诱导饲养4周后，以空腹血糖FBS及OGTT 2 h血糖均>11.1 mmol/L为成模标准。成模的ZDF大鼠随机区分为两组，模型组与电针组。8只ZL对照大鼠作为空白组。

2.2 电针治疗

2.2.1 空白组与模型组 采取相同的抓取和固定方式，捆绑时间同电针组，但不采取其他任何干预。

2.2.2 电针组 将大鼠捆绑于自制的固定器中,先将大鼠静置5 min，然后用75%的酒精对双侧“足三里”“三阴交”“脾俞”“胃脘下俞”穴消毒后进行针刺(足三里位于大鼠后膝关节下方，腓骨头下3 mm处的肌沟中; 三阴交位于大鼠后肢内踝尖直上10 mm处; 脾俞位于第11胸椎棘突下旁开7 mm处；胃脘下俞位于第8胸椎棘突下旁开7 mm处);向下斜刺胃脘下俞穴，直刺足三里穴，深度约4 mm，采取平补平泻的手法行针1 min后接通电针仪，一端连接足三里，另一端连接同侧胃脘下俞，每隔1 d换另一侧接电针，调节频率15 Hz，电流强度为4～6 mA(大鼠肢体保持轻微抖动)，干预时长20 min/次。周一至周六上午8:00开始进行干预，周日休息，共干预4周。

2.3 标本采集检测

干预4周后，于取材前1日22:00禁食过夜，可自由饮水，次日8:00以2%戊巴比妥钠溶液按照45 mg/kg的药量比腹腔注射麻醉，腹主动脉取血5～10 mL于离心管中，4 ℃条件下3 000 r/min离心15 min，快速分离血清，取上清以放射免疫法检测各指标。剪取部分肝脏组织于-80 ℃冰箱中保存，用蛋白印迹法检测AMPK、GLUT4蛋白含量表达。

2.4 统计学处理

3 实验结果

3.1 干预前后各组大鼠空腹血糖情况

在干预前，模型组空腹血糖明显高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，电针组空腹血糖与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。干预后，模型组空腹血糖与空白组比较，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，电针组与模型组比较，空腹血糖有显著降低，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，说明电针对于2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠血糖具有明显调节作用。见表1。

表1 各组大鼠干预前后空腹血糖比较

3.2 干预后各组大鼠血清中血脂各指标比较

干预后，模型组大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL和vLDL较空白组大鼠均明显上升(P<0.01)。电针组大鼠血清中TC、HDL较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，电针组大鼠血清中LDL、vLDL较模型组显著下降，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。说明电针可改善2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠血清中TC、HDL、LDL和vLDL水平。见表2。

表2 各组大鼠干预后血清中血脂各指标比较

3.3 干预后各组大鼠血清中胰岛素INS、C-P水平及OGTT实验曲线下面积比较

由表3可知，干预后模型组大鼠胰岛素INS、C-P水平较空白组均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，与模型组相比电针组胰岛素INS水平显著下降，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，电针组C-P水平较模型组有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)；干预前后，模型组OGTT曲线下面积均高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，干预前，电针组OGTT曲线下面积与模型组差异无统计学意义(P>0.05)，说明具有可比性，干预后，电针组OGTT曲线下面积与模型组相比有明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。说明电针可有效改善2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠血清中胰岛素INS、C-P水平以及糖耐受水平，从而改善胰岛素抵抗。

表3 各组大鼠干预后血清中胰岛素INS、c肽水平及干预前后OGTT实验曲线下面积比较

3.4 干预后各组大鼠血清相关转氨酶水平比较

如表4所示，干预后，模型组AST水平与空白组相比升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，电针组AST水平与模型组相比有下降但差异无统计学意义(P>0.05)；模型组ALT、GGT水平与空白组相比均明显升高，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，与模型组相比，电针组ALT水平有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，电针组GGT水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。说明电针可以调节2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠血清中相关转氨酶水平，从而减少肝细胞损伤程度。

表4 各组大鼠干预后血清中相关转氨酶水平比较

3.5 各组大鼠肝脏组织中AMPK、GLUT4含量表达差异比较

如图1、表5所示，模型组与空白组比较，大鼠肝脏组织中AMPK、GLUT4 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01); 电针组与模型组比较，大鼠肝脏组织中AMPK、GLUT4 蛋白表达明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)，说明电针可以良性调节胰岛素传导信号通路上的关键分子AMPK、GLUT4蛋白含量。

图1 各组大鼠AMPK、GLUT4蛋白表达情况

表5 各组大鼠AMPK、GLUT4 蛋白表达比较

4 讨论

研究报道证实，针刺在治疗T2DM中具有重要优势，作用机制与改善IR关系密切。针刺可以多层次多方位地有效调节糖脂代谢和激素分泌，从整体水平上改善IR[8]。肝脏是IR的起点，IR见于多种慢性肝损伤。改善IR对各类肝病的治疗具有积极影响[2]。本课题组长期从事于糖尿病的研究并在多年临床中总结出电针降糖经验穴组。本研究采用的电针穴位“脾俞、胃脘下俞、足三里、三阴交”在前期已被证明对T2DM有非常好的疗效，“三阴交”为肝脾肾三经的交会，“足三里”为胃经合穴，可改善糖尿病消谷善饥症状，“脾俞”调节相应的脏腑功能主运化升阳气，改善机体水液代谢从而改善胰岛素分泌，“胃脘下俞”是糖尿病的经验穴。此4个穴位符合糖尿病“阴虚为本、燥热为标”的基本病机。在中医经典理论中2型糖尿病属于“消渴”范畴。《灵枢·本脏》曰：“肝脆则善病消瘅易伤”，最早论述了消渴病与肝脏具有密切关系，强调肝失疏泄、肝郁气滞是消渴病重要的发病机理[9]。有临床研究显示，疏肝健脾、补益肝肾等从肝的层面治疗糖尿病能改善IR、调节糖脂代谢紊乱[10]。糖尿病与肝病相互影响互为危险因素,所以糖尿病患者应积极关注肝脏健康。

本研究中，笔者采用高脂高糖Purina #5008饲料喂养全部动物，成功建立了T2DM胰岛素抵抗大鼠理想模型。由实验数据得知，干预结束后电针组相对于模型组的空腹血糖显著降低，表明电针可调控血糖的上升趋势且对降糖有明确的优势作用。电针组大鼠干预后有效降低了TC、HDL、LDL和vLDL水平含量，对于改善糖尿病心血管并发症有较好作用，有效改善糖脂代谢紊乱。INS、C-P均是由胰岛β细胞所释放，参与机体糖代谢过程，INS、C-P水平可反应胰岛β细胞分泌功能[11]，本研究干预后电针组INS、C-P水平均明显下降，说明电针能够通过调控INS、C-P从而改善胰岛β细胞分泌功能，缓解胰岛素抵抗，OGTT实验作为诊断糖尿病的“金标准”，本实验OGTT曲线下面积也表明，电针组能明显改善T2DM胰岛素抵抗大鼠的糖耐受情况。胰岛素发挥作用的关键时刻就是与靶细胞中特异受体结合，激活相关通路，使肝细胞发挥正常功能，从血液中摄取糖分保证血糖正常。故在糖尿病治疗中，如肝脏发生损伤，肝脏细胞表面受体活性降低，会导致胰岛素结合力降低。此实验干预后模型组大鼠血清中AST、ALT和GGT3项水平均明显升高，肝细胞受损严重，电针组AST水平与模型组相比有所下降但差异较小无统计学意义，可能由于电针调控肝细胞的作用机制靶点不主要是AST，另一方面可能由于干预时间较短或本研究统计数量不够充足。李雪等[12]通过对2402名成人体检者的血清血脂、肝脏转氨酶的临床检测得出AST对于相关肝脏疾病的反应不如ALT、GGT灵敏。GGT是肝胆功能异常的重要指标,可作为糖耐量受损或早期糖尿病发生的关键独立预测因素[13]。本研究中电针组ALT水平与模型组相比虽无差异，但比较其均值有所降低，说明电针对ALT调控有下降趋势，电针组GGT水平较模型组有明显下降(P<0.05)，结合本实验电针组显著性的降糖结果从而验证了之前各项研究结果即对于糖代谢敏感度AST

综上所述，电针可以有效地治疗2型糖尿病，降低血糖血脂，降低相关血清酶学指标,改善胰岛素信号通路中的关键分子蛋白含量，相比于药物的局限性和伴随的副作用，电针具有经济安全几乎无副作用的优势，结合此实验中降糖穴的优势穴组加辨证论治，可更好地应用于临床。但因为糖尿病发生胰岛素抵抗是一种慢性代谢性疾病，肝脏作为参与各种代谢的枢纽，预测糖尿病发生最敏感的器官之一，本实验只有转氨酶酶学指标及1条信号通路AMPK、GLUT4的研究，肝细胞中还可能存在其他靶点改善肝脏损伤，后续笔者将会进行更深入的实验研究来探讨糖尿病代谢性疾病的发展中肝细胞形态及肝细胞内其他胰岛素信号传导通路等的变化,以便更好地指导临床实践。