艾灸对脾胃虚寒型肠易激综合征大鼠肠粘膜机械屏障的影响及机制研究*

李 丹，李 佳，吴 松

(湖北中医药大学针灸治未病湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430061)

肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是常见的以腹痛、腹胀和腹泻为主症的功能性肠病。临床IBS患者占消化门诊量的30%～50%,且发病率逐年上升[1]，IBS临床证型复杂，但多与脾虚相关。脾胃虚寒型IBS多由外感或内生寒邪伤及脾阳，导致机体免疫功能低下，临床常反复发作,其发病机制未完全明确。研究表明[2-4]，当病邪侵袭机体时，肠道粘膜启动保护机制的同时肠粘膜的紧密结构也会遭到破坏，肠粘膜上的紧密连接蛋白(ZO-1)、闭合蛋白(Claudin-1)和闭锁蛋白(Occludin)等相关蛋白也会减少，肠道通透性改变可引起高敏感性。另外炎症激活的肥大细胞释放的大量5-羟色胺(5-HT)和5-羟吲哚乙酸(5-HAII)会引起内脏的高敏感性及肠道动力障碍。IBS目前缺乏确定的治疗方案和特异性药物。研究表明[5]中医治疗IBS效果显著，但针灸治疗IBS机制尚不清楚，多从缓解肠道炎症和增强免疫功能等方面论述。中医辨证施治可缓解IBS大多症状，减少复发。实验证明[6-7]对机体热敏感的穴位进行施灸可有效治疗IBS。本次研究选择对足三里、神阙等穴进行艾灸干预，以AWR、5-HT、5-HAII、occludin、claudin-1和肠道的超微结构为观察指标，探讨中医外治法艾灸对IBS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

购SPF 级10周龄体质量相近的 Wistar大鼠 30只。适应性喂养3 d后，随机平均分为 3组，空白对照组、模型组和艾灸组。动物饲养在湖北中医药大学标准动物房中进行，生产合格证号：SCXK(鄂)2018-0026，环境安静，温度和湿度适宜。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 仪器 10F双腔导尿管(康乐保医疗用品有限公司)；压力换能器(成都泰盟软件有限公司)；冷冻离心机(Kendro Labrotary公司，德国)；组织脱水机、组织包埋机(Thermo Scientific公司，美国)；切片机(徕卡显微系统贸易有限公司)；恒温摊烤片机(湖北安立信医疗有限公司有限责任公司)；BX53型生物显微镜(Olympus公司，日本)；T-100型PCR仪(Bio-Rad 公司，美国)。

1.2.2 试剂 艾条(10 mm×12 mm)、PBS缓冲、电泳缓冲液、转膜液、ECL显影液、染色剂、occludin抗体、claudin-1抗体、细胞分离液和裂解液、ELISA试剂盒。

1.3 模型制备

D-IBS多由多种致病因素共同刺激下发生，故选用单一刺激方式制备IBS大鼠模型存在局限，本研究用束缚应激联合冰水游泳和番泻叶灌胃制备脾胃虚寒型IBS大鼠模型。参照文献方法[8]：具体操作:将模型组、艾灸组大鼠用绳每天将其四肢束缚1 h，限制其活动，然后将大鼠放入4 ℃冰水池中游泳15 min，1次/d，连续14 d，冰水刺激及束缚刺激同时每天下午番泻叶水煎液10 mL/kg灌胃，连续14 d。空白对照组大鼠用生理盐水灌胃(10 mL/kg/d)，不进行冰水刺激和束缚刺激。结果显示模型组、艾灸造模成功，造模过程中无大鼠死亡。

1.4 干预方法

参照《实验针灸学》[9]以及Chang Shik Yin等制定的“大鼠针灸穴位图谱”[10]对足三里和神阙穴定位。定位后在穴区剃毛。将大鼠置于艾灸固定架上后用艾条一端对准相应穴区上2 cm，将点燃艾条施灸，每穴15 min，1次/d，共14 d，记录艾灸前和艾灸后大鼠尾部温度情况[7]。空白对照组：饲喂普通饲料，不做任何处理,用KD表示；模型组：建立D-IBS模型并每日进行抓取训练和鼠衣穿脱训练，共14 d，用MX表示；艾灸组：建立D-IBS模型后每日艾灸足三里、神阙穴，共14 d，用AJ表示。

1.5 检测指标

1.5.1 AWR评分 将小儿导尿管制成的扩张球囊与注射器、压力换能器和三通阀连接，将大鼠固定在桌面上，用石蜡油润滑球囊导管后插入大鼠直肠6 cm，然后将导管束在大鼠尾端，防止滑出。待大鼠适应后用注射器向球囊内注入生理盐水，观察压力换能器连接的信号采集系统，记录大鼠出现评分为4分表现时的压力值。每只大鼠刺激 3次, 取平均值[11-12]。AWR评分标准见表1。

表1 AWR评分标准

1.5.2 5-HT、5-HAII浓度 电针干预结束后，各组大鼠禁食不禁水24 h，麻醉后从腹主动脉中采集动脉血5 mL，离心分离血清，ELISA法检测血清中5-HT、5-HIAA浓度[13]。

1.5.3 肠黏膜超微结构取结 肠组织3块于2.5%戊二醛和锇酸固定，PBS漂洗，丙酮脱水，环氧树脂包埋，烤箱烤48 h后修块定位，切片染色，透射电镜观察结肠组织肠黏膜超微结构[14]。

1.5.4 occludin和claudin-1蛋白表达水平 取结肠组织置EP管中，加入LysisBuffer，冰浴半小时，析出蛋白后4 ℃离心，12 000 rpm，10 min，取其上清液，BCA法测蛋白浓度。配置凝胶、SDS-PAGE电泳、转膜、一抗二抗的孵育、显影、定影和剪取PVDF膜上的目的条带，用凝胶成像系统采集图像,ImageJ软件分析数据[15-16]。

1.6 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，对于正态分布数据采用方差分析和t检验，非正态分布数据用中位数(四分位数间距)表示。非正态分布且方差不齐,用Kruskal-Wallis H检分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠AWR评分4分时结肠球囊扩张(CRD)压力比较

与KD比较，MX和AJ当AWR评分为4分时CRD压力值减少,差异有统计学意义(P<0.05);与MX比较，AJ的CRD压力值显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠AWR评分为4分时结肠球囊扩张(CRD)压力比较

2.2 各组大鼠血清中5-HT、5-HIAA浓度比较

与KD比较，MX、AJ大鼠血清中5-HT、5-HIAA含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与MX比较，AJ大鼠血清中5-HT、5-HIAA含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中5-HT、5-HIAA浓度比较

2.3 电镜各组大鼠肠粘膜结构比较

如图1所示，KD大鼠肠粘膜微绒毛长度均匀一致，排列整齐且紧密，连接完整，清晰可见，上皮细胞排列整齐且形态结构完好；MX肠粘膜微绒毛稀疏，长短不一，排列欠整齐，有少许断裂，上皮细胞结构被破坏，间质内充满高密度颗粒；AJ肠粘膜微绒毛排列较整齐，紧密连接完整，较清晰,上皮细胞形态正常，胞膜完整，间质内无高密度颗粒。

图1 各组大鼠结肠黏膜结构图(1 700×)

2.4 各组大鼠claudin-1、occludin蛋白表达比较

与KD比较，MX和AJ大鼠结肠组织中claudin-1、occludin蛋白表达显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与MX比较，AJ大鼠结肠中claudin-1、occludin蛋白表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。

表4 各组大鼠claudin-1、occludin蛋白表达比较

图2 各组大鼠Claudin-1、Occludin蛋白表达

3 讨论

近年来IBS是消化科门诊的常见病,《中国临床诊疗术语》确定IBS病名为“肠郁”[17]。IBS无明确的器质性病变，西医尚无明确治疗方案。研究表明[18]针灸对治疗功能性胃肠疾病有良好的疗效。中医认为其病机为心脾两虚，病理因素主要为气虚、阳虚兼有内寒、内湿和内热等[19]。情志失调多为诱因，病机为脾失健运兼心神失调。临床常见的IBS症型有：脾胃虚寒、肝气脾虚、肝郁气滞、脾胃湿热和寒热错杂等。其中脾胃虚寒证较为多见，多由贪凉饮冷所致。治疗上宜健脾胃为主，调心神为辅。临床上中医外治法治疗IBS方法众多,而辨证论治是针灸治疗疾病的基础[20]，故本次实验选用足三里、神阙穴施灸，可改善患者脾胃虚寒引起的症状，恢复脾胃的运化功能，增强机体免疫力，对治疗脾胃虚寒型IBS有显著疗效。足三里乃胃之下合穴，“肚腹三里留”，足三里固护脾胃化生的后天之气。神阙穴可培元固本、和胃理肠。灸之可显著改善患者阳虚症状，研究表明[21-22]艾灸治疗IBS疗效确切,对改善机体免疫力、增强机体抗病能力有一定作用。

肠粘膜的机械屏障是由肠上皮细胞和细胞之间的黏连蛋白构成[23]。肠粘膜上有大量的黏连蛋白。其中Occludin、Claudin-1是非常重要的紧密连接蛋白[24]。Occludin能调节和维持肠道通透性，参与细胞内信号传递。当Claudin-1表达异常时会导致组织渗透性改变而引起水钠代谢失衡，从而引起腹泻。当致病因素侵袭时，肠粘膜的紧密连接蛋白会遭到破坏，肠道通透性增加，而肠道通透性改变又是内脏高敏感性的重要原因之一，肠道高敏感性和肠道动力障碍可引起腹痛、腹胀。当致病因素侵袭机体时，机体免疫系统启动应激机制，肥大细胞会释放大量5-HT，5-HT参与中枢神经系统与胃肠道系统之间的信号传递[25]，释放后的5-HT会与肠粘膜上的5-HT受体结合，使胃肠动力发生异常改变，从而加重腹痛、腹泻。5-HIAA是5-HT被肥大细胞内的单胺氧化酶(MAO)降解的产物，5-HIAA的浓度可以反映5-HT在肥大细胞内的代谢情况[26]。故5-HT、5-HIAA浓度的变化可以反应肠粘膜上免疫系统的活性。而机体的免疫功能是由机械屏障和免疫屏障共同构成，二者之间相互影响。

此次研究发现IBS患者肠粘膜处于旺盛分泌和高度活跃的状态，其肠粘膜超微结构发生很大的改变，艾灸可促进IBS患者肠粘膜的修复，维持神经-免疫-内分泌系统的正常运转，减轻临床症状。