液相色谱-串联质谱法检测类固醇激素在CAH筛查中的应用进展

金陈飞，崔梦竹，梁红艳，姜晓峰

哈尔滨医科大学附属第四医院检验科，黑龙江哈尔滨 150028

先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一组由于类固醇激素合成代谢中某种酶缺乏导致皮质醇合成障碍为主要特征的常染色体隐性遗传病，会导致肾上腺皮质生成类固醇激素的水平发生改变，并且根据疾病分型不同，激素水平变化有明显差异。

类固醇激素又称为甾体激素，是胆固醇经一系列酶催化而来的高效能物质，主要分为肾上腺皮质激素、性激素和维生素D。各种类固醇激素在体内水平极低，一般检测水平在nmol/L或pmol/L数量级，因此寻找一种可靠、特异的分析方法成为临床疾病诊断的首要任务。

目前类固醇激素的检测手段主要包括放射免疫分析技术、化学发光免疫分析技术、酶联免疫吸附测定、气相色谱质谱分析法、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[1-2]。免疫分析法具备操作简单、快速的优点，然而RAUH[3]研究显示，免疫分析法灵敏度较低，易引起交叉反应造成假阳性，无法同时检测同一标本中的多种激素水平，无法实现类固醇代谢谱的高效、深入、准确的研究。WILSON等[4]研究表明，孕酮测定受不同类固醇(包括17α-羟孕酮、11-去氧皮质酮、20-二酮)所引发的高达10%的交叉反应影响，导致免疫检测结果偏高。而LC-MS/MS凭借高通量、灵敏度高、特异度高、检测标本多样、检测动态范围宽等优势在CAH临床诊断中的地位越来越重要[5]。

1 CAH类固醇激素代谢通路及主要的CAH分类

CAH是肾上腺皮质功能减退较常见的原因之一。根据酶缺乏将CAH分为7型，具体各型详见表1，不同酶缺陷时呈现不同的生化和临床表现。肾上腺皮质类固醇激素合成代谢途径见图1。

表1 常见临床CAH分型

图1 肾上腺皮质类固醇激素合成代谢途径

21-OHD是CAH中最常见的类型，临床可分为3型，分别为失盐型、单纯男性化型及非经典型。在肾上腺皮质类固醇激素合成代谢途径中，21-羟化酶催化17-羟孕酮转化为11-脱氧皮质醇和催化孕酮转化为11-去氧皮质酮，两者分别为皮质醇和醛固酮的前体。因此，CAH患者类型为21-OHD时皮质醇和醛固酮有不同程度的合成不足或完全缺乏，同时上游底物(17-羟孕酮和孕酮)水平因堆积而明显升高，因此，17-羟孕酮水平显著升高成为诊断21-OHD最有意义的指标，临床通常根据17-羟孕酮水平的改变评估治疗效果。因此，17-羟孕酮已被大多数国家纳入新生儿筛查项目，这有助于快速检测出21-OHD患儿。然而该项检查受到较多因素干扰造成检测结果假阳性高。由于脐带血中17-羟孕酮水平很高，所以新生儿在出生1～2 d内17-羟孕酮往往高于临界值，并逐渐下降。此外，早产儿和许多因其他疾病引起生理应激的足月婴儿中，17-羟孕酮水平往往比实际水平高，筛查测试的阳性预测值在早产儿中仅为0.4%，而在足月儿中为30.1%[12-13]，因此建议对所有17-羟孕酮水平升高的新生儿在1个月后进行第2次LC-MS/MS筛查。

11β-OHD的主要生化异常为低血钾，但是严重度因基因突变类型而异，甚至可出现血钾正常的情况。其他生化指标变化体现在血17-羟孕酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮水平升高，血清皮质醇、醛固酮水平降低，血肾素活性减低。此外，该症的特征性指标是血和尿11-脱氧皮质醇和去氧皮质酮水平升高，尿中二者的主要代谢产物四氢11-脱氧皮质醇及四氢去氧皮质酮水平升高，这是与21-OHD进行鉴别的关键指标。

2 LC-MS/MS法检测类固醇激素方法学的建立

目前检测类固醇激素的生物标本主要有血清、血浆、毛发[14]、尿液[15]、唾液[16]、子宫内膜[17]等。在方法开发建立的过程中可通过以下几个步骤提高检测性能。(1)标本处理：良好的标本前处理方法可以起到富集目标组分、消除或降低基质干扰、提高灵敏度的作用，反之则会容易引入误差并延长分析时间。目前血液中类固醇激素的前处理方法有蛋白质沉淀、液液萃取和固相萃取，而多种前处理方法相结合具有低基质效应、回收率高、灵敏度高、自动及快速等优点，已逐渐受到临床关注[18]。(2)检测过程：要针对检测项目的特点选择合适的色谱柱、流动相流速、离子源和质量分析器，类固醇激素检测通常与三重四级杆质量分析器或三重四级杆串联线性离子阱质量分析器串联，采用电喷雾离子源或大气压化学电离源，并利用多反应监测模式对靶向代谢组进行分析，按离子质荷比的大小顺序进行收集和记录，进而得到质谱图用于结果分析。为了避免内源性或外源性基质物质的干扰，降低待测物信号的损失和信号波动，可在同一批分析中的所有标本中加入等体积的内标液，绝大部分待测物的信号波动和量的损失都可以得到校正。内标通常分为2型，即结构类似物内标和同位素标记内标，在类固醇激素检测时常常选择同位素标记内标[19]。新生儿筛查CAH时常常检测的激素与相应内标检测信息见表2。同时为确保准确度及批间或批内精密度，每次测量时均应准备质控品。(3)数据处理：合理的分析方式能为实验研究提供更加精准的结果，保证结果的可靠性。质谱数据处理一般采用质谱仪对应的数据处理软件，用空白提取液配制标准品做标准曲线，有效排除干扰因素，可以保证高通量、高准确性的数据处理。

表2 新生儿筛查CAH时常检测的激素与相应内标

续表2 新生儿筛查CAH时常检测的激素与相应内标

为了确保检测结果准确可靠，需要对检测方法进行性能评估，主要包括检测下限与定量下限、精准度、线性关系、选择性、稳定性、准确度、表观回收率、基质效应等。TRAVERS等[26]建立了LC-MS/MS检测血清中15种类固醇激素的方法，采用蛋白质沉淀和固相萃取相结合的方法提取血清甾体化合物和氘化内标物，回收率从21-脱氧皮质醇的64%到皮质醇的101%不等，并与免疫分析法比较，2种方法检测皮质醇，脱氢表雄激素和睾酮的结果较一致，免疫分析法检测醛固酮数值偏低，孕酮水平低于2 ng/mL的17-羟孕酮、雄烯二酮和11-脱氧皮质醇水平明显偏高。分析这种差异产生的原因：(1)免疫分析法抗体特异性低导致的交叉反应，例如来自胎儿肾上腺区的类固醇单硫酸盐，主要是17-羟基孕烯醇酮硫酸盐导致免疫测定中17-羟孕酮水平错误升高[27]；(2)LC-MS/MS在提取过程中加入了内标液，可以有效提升检测特异性。

3 LC-MS/MS在CAH诊断中的应用现状

新生儿筛查目的在于在症状出现之前尽早发现并准确诊断CAH等先天性疾病，而通常所用的免疫分析法(一级筛查)常常出现假阳性，增加了患者的心理负担和经济压力。2018年由美国内分泌学会专家组发布的21-OHD临床实践指南(第二版)与2010年发布的第一版指南比较，新增新生儿筛查时推荐一级筛查采用常规方法检测17-羟孕酮，并推荐了优先采用LC-MS/MS进行二级筛查，不推荐其他方法(如基因分型)，以此提高CAH筛查的阳性预测值[28-29]。SCHWARZ等[30]发现CAH患病率和血清17-羟孕酮水平随着新生儿体质量增加而降低，皮质醇的水平随采样时年龄不同而发生明显变化，未观察到17-羟孕酮或雄烯二酮与年龄有明显相关性。值得注意的是雄烯二酮是较敏感的雄激素，并且其水平较17-羟孕酮稳定，且受皮质醇替代治疗时给药间隔时间的影响较少，也不受性别、疾病类型和抽血时间的影响，与17-羟孕酮有较好的相关性。在这项研究中作者证实(17-羟孕酮+雄烯二酮)/皮质醇是CAH的最佳判别方法，但若二者比值大于4时需注意是否在采样之前使用了糖皮质激素类药物，避免假阴性结果的发生。

2010年欧洲内分泌协会临床指导委员会制订的21-OHD临床应用指南[28]指出经典型CAH患者17-羟孕酮水平通常高于300 nmol/L，非经典型CAH患者17-羟孕酮水平在6～300 nmol/L，当17-OHP<6 nmol/L时不支持CAH诊断。因此根据17-羟孕酮检测水平对CAH疾病准确分型，进而辅助临床精准治疗具有重要意义。AMBROZIAK[31]等证明了与LC-MS/MS比较，免疫分析法检测17-羟孕酮可能会增加非经典型CAH假阳性诊断的风险。由此可见，LC-MS/MS检测17-羟孕酮在CAH诊断分型中具有重要意义。

目前，临床多将17-羟孕酮水平是否升高作为新生儿筛查时判断是否患21-OHD的首要指标，但表1中其他形式的CAH也可能导致检测到17-羟孕酮水平升高[32]。由图1可看出21-OHD患者缺乏21-羟化酶会使17-羟孕酮的下游产物11-脱氧皮质醇水平降低，21-脱氧皮质醇水平升高。因此，有研究者提出21-脱氧皮质醇作为21-OHD的另一标志物，那么21-脱氧皮质醇是否可以在一定程度上取代17-羟孕酮在21-OHD诊断中的地位有待研究。JANZEN等[33]建立的LC-MS/MS不仅避免了免疫分析法诊断CAH时的假阳性高的问题，还发现可以通过计算(17-羟孕酮+21-脱氧皮质醇)/皮质醇的数值进一步提高LC-MS/MS的灵敏度，在242 500例新生儿中，1 609例初筛试验阳性，而通过计算确定了其中已确诊的16例21-OHD患者，没有误报。由此可见，在二级筛查时可更多关注21-脱氧皮质醇的水平变化，并且选择合适的计算公式来提高检测方法的灵敏度，这也为CAH的诊断提供了新思路。

4 结 论

综上所述，类固醇激素水平精准定量检测对于CAH的诊断和确切分型具有重要意义。LC-MS/MS最主要的优势就是高通量、灵敏度高、特异性强、检测标本多样、检测动态范围宽等，目前有望取代免疫分析法。但由于LC-MS/MS标本处理操作复杂，自动化程度较低，需要操作人员进行规范化培训才可应用于临床。因此，简化标本处理操作流程、实现全自动化是目前面临的挑战，也是研究的焦点。