人类白细胞抗原DR的表达水平与HBV感染不同转归的关系

樊小群，李 欢，朱华雄，蔡庆果，何吕芬

海南省三亚市人民医院检验科，海南三亚 572000

随着慢性乙型肝炎(CHB)临床治愈观点的提出，研究引起乙型肝炎病毒(HBV)感染不同转归的因素尤为重要，宿主基因变异可能影响HBV感染的不同转归[1]。人类白细胞抗原(HLA)是人类主要的组织相容性复合体(MHC)，是HBV感染的重要宿主因子之一。HLA基因多态性不仅与HBV的自发清除、血清转化、CHB的持续感染密切相关，而且与疾病进展、肝硬化和HBV相关性肝癌的发展密切相关[2]。HLA-DR表位在抗HBV感染中发挥重要作用，且全基因组关联研究已确定HLA-DR是HBV相关慢、急性肝衰竭易感的主要位点[3]。抗HBV感染免疫研究表明，HLA-DR对HBV感染不同转归的影响可能是由于肽-主要组织相容性复合物(pMHC)与T淋巴细胞受体(TCR)相互作用，从而影响初始T淋巴细胞的分化途径，pMHC与TCR相互作用的变化主要受HLA分子结构或表达水平的影响[4]。已有研究明确HLA-DR分子结构与HBV慢性感染相关[5]，而对于HLA-DR mRNA的表达水平在HBV感染临床转归中的作用报道较少，目前HLA-DR mRNA表达水平作为判断脓毒血症和食管癌等疾病预后的指标[6-7]，因此探讨HLA-DR在HBV感染临床转归中的特点有十分重要的意义。本研究选择本地区人群中急性、急性自限和不同疾病阶段的慢性HBV感染者，疫苗免疫者和乙型肝炎5项[血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)、乙型肝炎E抗原(HBeAg)、乙型肝炎E抗体(抗-HBe)、乙型肝炎核心抗体(抗-HBc)]结果阴性的健康人群，采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组外周血单个核细胞(PBMC)中HLA-DR mRNA的表达水平，分析在不同HBV感染者中HLA-DR mRNA的表达水平差异；HLA-DR mRNA表达水平与疫苗免疫的关系；HLA-DR mRNA表达水平与HBeAg抗原血清学转化的关系，为HLA-DR mRNA表达水平在HBV感染患者的预后评价提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择本院2014年8月至2017年10月住院和门诊HBV感染患者101例及体检中心的体检健康者53例为研究对象，均为汉族，无血缘关系。HBV感染患者符合2010年修订的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[8]中的相关标准：(1)HBsAg阳性、HBeAg阳性或者阴性、抗-HBe阳性或者阴性，HBV-DNA阳性；(2)丙氨酸氨基转移酶(ALT)持续或反复升高，或在肝组织学检查中发现肝炎病变；(3)未经抗病毒治疗。排除标准：(1)合并其他类型肝炎病毒感染；(2)合并心、肾和造血系统严重疾病、自身免疫性疾病、肝硬化、肝癌。本研究经本院伦理委员会批准，受试者均知情同意并签署知情同意书。

本研究共纳入急性HBV感染者7例为急性组；不同感染阶段的慢性HBV感染者64例为慢性组(CHB轻度感染24例，中度感染12例，重度感染8例，携带者20例)；急性自限者30例为急性自限组。体检健康者53例，其中疫苗免疫者35例为疫苗免疫组，乙型肝炎5项全阴者18例为5项全阴组。急性自限组：既往否认有肝炎病史或抗HBc-IgM检测阴性，HBsAb、HBeAb和抗-HBc均为阳性。疫苗免疫组：经HBV疫苗免疫且乙型肝炎5项检测结果HBsAb阳性，其余4项均阴性。5项全阴组：即乙型肝炎5项检测结果均为阴性。

1.2方法

1.2.1临床资料收集 记录受试者的性别、年龄、ALT、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)和乙型肝炎5项等指标，并采集外周血2 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，离心分离血浆和血细胞备用。

1.2.2HBV-DNA检测 受试者血浆按HBV核酸定量检测试剂盒说明书(购自深圳凯杰生物工程有限公司)进行HBV-DNA提取、扩增和定量检测。MX3000P qPCR仪购自美国Stratagene公司。

1.2.3HLA-DR mRNA表达水平检测 受试者血细胞使用人外周血淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司)制备PBMC备用；使用RNA提取试剂盒(购自北京百泰克生物有限公司)提取总RNA，使用反转录试剂盒(购自北京百泰克生物有限公司)进行反转录，使用探针法qPCR试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)检测各组HLA-DR和β-actin mRNA表达水平，分别记录循环阈值(Ct)值，并用2-ΔΔct法进行HLA-DR mRNA表达水平相对定量分析。HLA-DR和β-actin的引物和探针购自上海吉玛公司。HLA-DR序列F：5′-GAC TTG ATG CTG ATG AGA TTT TCC-3′，R：5′-GAG CCT CAA AGC TGG CAA ATC-3′。β-actin序列F：5′-CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA-3′，R：5′-CAC CTC CCC TGT GTG GAC TT-3′。

2 结 果

2.1一般资料比较 4组性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，年龄、ALT、AST和TBIL水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，符合该疾病分布状态。见表1。

表1 一般资料比较

2.2HLA-DR mRNA表达水平与不同HBV感染者及疫苗免疫的关系 HLA-DR mRNA表达水平在急性自限组(2.75±0.57)中最高，5项全阴组(0.99±0.36)中最低，各组组间比较差异有统计学意义(F=9.75，P<0.05)。其中，急性自限组、慢性组(2.51±0.23)HLA-DR mRNA表达水平高于疫苗免疫组(1.83±0.21，t=4.767、4.576，均P<0.05)，但急性自限组、慢性组和急性组(1.92±0.55)比较，差异无统计学意义(t=2.550、1.910，均P>0.05)。慢性组、疫苗免疫组HLA-DR mRNA表达水平均高于5项全阴组(t=7.346、3.374，均P<0.05)。

2.3HLA-DR mRNA表达水平与不同感染阶段慢性HBV感染者的关系 重度(2.98±1.03)、中度(2.54±0.76)、轻度(2.50±0.87)慢性HBV感染者HLA-DR mRNA表达水平和HBV携带者(1.72±0.60)比较，差异无统计学意义(F=0.540，P=0.657)。

2.4慢性HBV感染者HLA-DR mRNA 在不同 HBV-DNA表达水平中的比较 慢性HBV感染者共64例，随机选取其中62例患者进行HBV-DNA定量检测，根据HBV-DNA水平不同分6组[<1×103、(1×103～<1×104、1×104～<1×105、1×105～<1×106、1×106～<1×107、≥1×107IU/mL]，其HBV-DNA mRNA表达水平分别为1.81±0.69、1.71±0.58、2.84±0.92、3.44±1.45、1.88±0.60、1.42±0.39。不同HBV-DNA水平组HLA-DR表达水平比较，差异无统计学意义(F=1.204，P=0.319)。但是在HBV-DNA水平为1×103～<1×104IU/mL，1×104～<1×105IU/mL时，其HLA-DR mRNA表达水平均较高，HBV-DNA mRNA水平为1×105～<1×106IU/mL的感染者HLA-DR mRNA表达水平最高，随着HBV-DNA的水平逐渐降低，PBMC中的HLA-DR mRNA表达水平呈先升高后降低的趋势。

2.5HLA-DR mRNA表达水平在慢性HBV感染者不同HBeAg血清学状态中的比较 HBeAg阴性的慢性HBV感染者HLA-DR mRNA表达水平(2.28±1.12)高于HBeAg阳性的慢性HBV感染者(1.48±0.65)，差异有统计学意义(t=3.267,P=0.069)。

3 讨 论

HBV感染后引起不同转归主要是宿主免疫系统对病毒抗原的免疫应答所致。免疫识别病毒需要HLA-Ⅱ类分子把病毒抗原呈递给CD4+T淋巴细胞后清除病毒或持续感染[9]。在HLA-Ⅱ类分子中HLA-DR最具多态性，HLA-DR分子在CD4+T淋巴细胞向Th1细胞分化的过程中起重要作用，不同HLA-DR表达水平在免疫功能中的作用不同。HLA-DR表达水平不同激活的CD4+T淋巴细胞功能亚群不同，致使其发挥不同抗病毒作用，进而导致不同转归[10]。有研究表明在慢性HBV感染者树突细胞和单核细胞中HLA-DR表达水平均低于对照组，并认为其可能是抗原递呈功能失调及体液和细胞免疫紊乱导致 HBV持续感染和患者病情迁延不愈的重要因素之一[11-12]。PBMC 作为免疫细胞的集合体，其在 HBV 感染过程中起着至关重要的作用，但目前关于HBV感染后PBMC中HLA-DR mRNA表达水平变化的报道较少。本研究对外周血PBMC中HLA-DR mRNA在不同感染组中的表达水平进行研究，发现急性自限组表达水平最高，慢性组次之，五项全阴组表达水平最低，不同HBV感染状态和疫苗免疫均可诱导HLA-DR mRNA表达水平不同程度地升高，原因可能是HLA-DR mRNA在静息T淋巴细胞上表达很弱，受抗原刺激后，HLA-DR被激活，产生细胞免疫，进而消灭细胞内感染的病原体[13]，这也与毛学锋等[14]发现慢性HBV感染者外周血PBMC中HLA-DR mRNA表达水平比健康对照组高的结论一致。

同时本研究对慢性HBV感染者的不同感染阶段、HBV-DNA水平、和HBeAg血清学状态进行了分层分析，发现了HBeAg阴性的慢性HBV感染者HLA-DR mRNA表达水平高于HBeAg阳性，与相关研究结果一致[15]，进一步证明HLA-DR mRNA水平与HBeAg血清学状态关系重大。HBV入侵时对机体免疫系统产生重大影响，章松平等[13]在慢性HBV感染者的研究中，发现病毒水平较高时，HLA-DR mRNA表达水平较低，与本研究相符。

TAN等[3]通过全基因关联研究已明确HLA-DR是HBV相关ACLF易感性的主要位点。 金茜等[16]研究发现，在重度乙型肝炎患者外周血中，HLA-DR mRNA表达水平高于中度和轻度乙型肝炎患者。本研究中，虽然HLA-DR mRNA表达水平在慢性感染者重度与中度中比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但整体仍然是重度感染者高于其他感染者，提示HLA-DR mRNA表达水平与肝细胞的损伤程度有关。

综上所述，本研究表明PBMC中HLA-DR mRNA表达水平能反映HBV感染和疫苗免疫状态，以及肝细胞的损伤程度，这可为HLA-DR评价HBV感染转归提供参考依据，对深入认识不同HBV感染临床转归机制和指导科学研究有重要意义，为HLA-DR mRNA表达水平在HBV感染患者的预后评价提供依据。