血栓心脉宁片抗动脉粥样硬化的网络药理学分析

吉 洁，梅 俊，朱 颖，张 颖，徐凤芹

随着我国人民生活水平的提高及老龄化进程的加快，与代谢相关的动脉粥样硬化性心脑血管疾病患病率逐年升高，由此引发的心血管病死亡占居民总死亡比例已超过40%[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中和外周动脉疾病等多种心脑血管疾病的病理学基础，因此，抗动脉粥样硬化研究一直是心脑血管疾病防治领域的研究重点。然而动脉粥样硬化是一个复杂的病理过程，涉及氧化应激、炎症反应、免疫应答、脂质代谢、血管重构等多种因素。根据动脉粥样硬化的临床表现，中医学将其归为“胸痹”“真心痛”“中风”等范畴。中医学认为其病机为脏腑、气血、津液功能失调，瘀血、痰浊、水饮等病理产物为其标，多采用益气活血化瘀、清热解毒、化痰祛浊等治法。

血栓心脉宁基于“血脉双治”理论研制而成，全方由川芎、丹参、毛冬青、水蛭、槐花、人工麝香、冰片、人工牛黄、人参茎叶皂苷、蟾酥等10味药组成。方中川芎活血行气，祛风止痛；丹参活血养血，止痛安神，两药配伍，气血并治，共为君药。水蛭破血逐瘀通经；麝香开窍醒神、止痛消肿；毛冬青清热解毒、通脉活血；槐花清肝泻火，活血解毒，共助君药通行血脉、逐瘀通痹、活血止痛，共为方中臣药。人参茎叶总皂苷扶正固元；冰片透达心脉，通经止痛；牛黄清心凉肝，清热解毒，三药共佐君臣活血化瘀、通络止痛，活血为主兼顾解毒清热之功。蟾酥解毒消肿，强心止痛，可加强君臣药的活血化瘀，又可引诸药直达病所，皆为佐使之用。全方合用，血脉同治，瘀毒并清，益气活血通脉，化瘀解毒。血栓心脉宁在临床治疗上广泛应用于缺血性脑卒中、心绞痛等疾病[2-3]。药理研究显示血栓心脉宁可抗心肌缺血[4]、改善血液流变学及抗血小板聚集[5]、改善微循环障碍[6]、抗氧化活性及保护血管内皮细胞[7-8]等。

中药包含多组分、多靶点，各组分之间可产生协同作用，形成的体系庞大复杂。网络药理学从多靶点研究策略出发，通过挖掘网络中关键节点和功能模块，分析药物、靶点、疾病之间的相互关系，超越了单靶点思想构建网络的束缚，其整体性、系统性的特点与中医学整体观念、辨证论治的理论特点不谋而合[9]。网络药理学将网络生物学概念、方法和技术应用到了药物相关的研究，其在药物靶点选择、新的适应证预测、挖掘药物研发规律等方面都应用颇广。本研究采用网络药理学研究方法，对血栓心脉宁片主要功效物质以及配伍机制进行研究，以期揭示血栓心脉宁片治疗动脉粥样硬化的作用机制及科学内涵。

1 资料与方法

1.1 血栓心脉宁片成分及作用靶标预测 血栓心脉宁片组成包括川芎、丹参、毛冬青、水蛭、槐花、人工麝香、冰片、人工牛黄、人参茎叶皂苷、蟾酥10味中药。本研究使用BATMAN-TCM平台[10]预测复方成分及其作用靶标。将血栓心脉宁片中10种中药组成分别导入BATMAN-TCM平台进行靶标基因预测及分析；之后通过计算“血栓心脉宁片化合物-靶标”与“已知药物-靶标”之间的相似性，对潜在的药物靶标相互作用进行score打分[11]，并以score≥20分的靶标作为潜在的靶标基因。

1.2 靶标基因富集分析 基于功能条目富集分析靶标，以此考察中药的潜在靶标及其可能具有的生物学功能、参与的生物学通路。靶标的富集分析涉及Drug Bank[12]、基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析[13]以及OMIM/TTD[14]。疾病的功能分析是基于超几何分布设计的算法，Benjamini-Hochberg校正方法进行多重校验[15]。如果靶标在这些条目上超几何分布校验后的P值小于设定值，即P<0.05，即可认为靶标在这些条目上富集。同时给出这些靶蛋白显著富集的KEGG生物学通路、GO功能注释条目(包括生物学过程、分子功能以及细胞定位三大类)、OMIM/TTD疾病通路，还有统计检验的P值、条目相关的基因数量和基因列表等信息。根据这些显著富集的KEGG生物学通路和GO功能条目，可以推测其可能在治疗疾病中发挥着重要角色，并且也为进行下一步分子作用机制的实验验证提供了些许线索。

1.3 分析与动脉粥样硬化相关的靶标基因与通路 将化合物与他们潜在的靶标、相关的疾病以及通路相关联，构建“组成化合物-靶标-生物学通路-疾病”的关联网络，这样能够探索不同组分潜在的作用机制。并且使用Cytoscape 3.2.0绘制关联网络图，将化合物、靶标、生物学通路及疾病以不同颜色和形状的节点来表示。

2 结 果

2.1 血栓心脉宁片的潜在靶标基因预测结果 通过BATMAN-TCM平台检索血栓心脉宁片所含化合物有789种，如川芎中的川芎嗪、藁本内酯、阿魏酸等，人参中的人参皂苷Re、Rb1、Rb2等。以化合物在BATMAN-TCM平台获取的靶标基因，score≥20分的靶标基因共有2 201个，现列出预测的24个潜在药物靶标基因。在UniProt数据库中检索这些基因对应的蛋白，包括与脂代谢相关的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、胆固醇逆转运相关的三磷酸腺苷结合转运体A1(ABCA1)、调节胆固醇摄取相关的核受体(NR1H3、NR1H2)、调节糖脂代谢的脂联素(ADIPOQ)等。详见表1。

2.2 潜在靶标分析的功能分布 利用生物学通路潜在靶标分析方法，分析了其中2 201个潜在靶标分子，发现其在94个功能条目显著富集(P<0.05)，如信号传导活性(signal transduction)、脂质代谢(lipid metabolic process)、细胞增殖(cell proliferation)等。部分显著富集的功能条目见表2。

表2 血栓心脉宁片部分靶标基因功能分布

2.3 潜在靶标基因分析KEGG通路分布及可视化呈现 通过生物学通路分析方法，分析了2 201个潜在靶标分子的KEGG生物学通路的分布，发现这些靶标分子倾向在环磷酸鸟苷-蛋白激酶信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)、腺苷酸活化蛋白激酶信号通路(AMPK signaling pathway)、转化生长因子β信号通路(TGF-β signaling pathway)、丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)等78个通路显著富集(P<0.05)。部分显著富集的生物学通路见表3。

表3 血栓心脉宁片部分靶标基因KEGG通路分布

2.4 生物学通路的可视化 靶标相互作用对象以及他们与上下游分子的调控关系，其可通过对靶标分析得到富集的KEGG生物学通路呈现。本研究中列出了潜在靶标在AMPK信号通路上的覆盖情况。详见图1。

图1 潜在靶标在AMPK信号通路的作用路径

2.5 潜在的靶标基因分析之疾病分布 利用靶标分析方法，分别基于OMIM和TTD数据进行了2 201个潜在靶标分子(score≥20分)的疾病富集分析，发现在26个TTD疾病条目显著富集(P<0.05)，如心律失常、心力衰竭、心血管疾病、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心脏相关疾病。部分显著富集的疾病见表4。

表4 血栓心脉宁片部分靶标基因显著富集的疾病分布

2.6 与动脉粥样硬化相关的潜在靶标-生物学通路/疾病的网络可视化 将238个化合物与他们的1 307个潜在靶标、相关的疾病(51个OMIM、95个TTD)与152个通路关联，同时针对显著富集的通路、疾病条目构建关联网络。本研究重点关注了动脉粥样硬化的潜在靶标-生物学通路/疾病的网络可视化。详见图2。在组成化合物-靶标-生物学通路-疾病的关联网络图中，不同类型的结果分别用不同的颜色和形状表示，其中绿色七边形表示草药，浅灰色正方形为组成化合物，红色圆形表示药物的潜在靶标，紫色的三角形为KEGG生物学通路，棕色正方形为疾病。在图2中还包含了三种联系(边)，化合物与靶标的联系、靶标与通路的联系、靶标与OMIM/TTD疾病的联系。靶标节点、生物学通路节点以及疾病节点的大小，会随着网络中的连接度而变化，一般连接度越大，节点越大。而相关的化合物数量决定靶标节点的连接度，相关的靶标数量决定生物学通路节点的连接度以及其与疾病条目节点的连接度。

图2 与动脉粥样硬化相关的潜在靶标-生物学通路/疾病网络

3 讨 论

本研究采用网络药理学方法预测到血栓心脉宁片的潜在靶标基因2 201个，有78条通路显著富集，如cGMP-PKG信号通路、AMPK信号通路、MAPK信号通路等，涉及血管功能的调节、脂质运输与降解、糖脂代谢等过程。有研究表明，cGMP-PKG信号通路在缺血再灌注损伤中发挥着重要作用[16]。AMPK作为调控能量稳态的重要激酶，是真核生物细胞和有机体代谢的中心调节剂之一，已有研究证明AMPK是一个参与多种信号传导通路的关键蛋白，对心血管疾病、肿瘤细胞等的治疗起着重要作用。MAPK信号通路参与动脉粥样硬化早期的炎症反应调控，有研究显示p38MAPK与血管内皮细胞的损伤有密切联系。

由图2可知，组方药物多个化合物共同作用于ADIPOQ、ABCA1、ROCK1、SCARB1等靶标，并且其直接参与胆固醇逆转运、胆固醇摄取、血管功能的调节，影响糖脂代谢等代谢过程，与心律失常、心力衰竭、心血管疾病、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心脏相关疾病联系紧密。研究显示，脂联素由ADIPOQ基因编码，参与心血管和代谢疾病的发病机制[17]。ABCA1是一种广泛表达于细胞内的跨膜转运蛋白，主要作用是通过控制细胞胆固醇和磷脂的流出来维持脂质稳态，具有抗炎作用，参与动脉粥样硬化等多种疾病[18-21]。研究显示，内皮间充质转化是动脉粥样硬化的主要特征，在高糖刺激下，ROCK1的激活在内皮间充质转化中起到了重要作用[22]。SCARB1在高密度脂蛋白胆固醇代谢中起到了重要作用，SCARB1的表达在动脉粥样硬化中具有保护作用，可能参与了冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病机制[23-26]。任智雄等[3]对血栓心脉宁片治疗气虚血瘀型心绞痛的有效性和安全性进行Meta分析，发现其可提高心绞痛改善率和心电图疗效率。血栓心脉宁片还参与了神经退行性疾病、糖尿病、代谢综合征、哮喘、癫痫等疾病。

本研究依据网络药理学的思路和研究方法，从分子水平揭示了血栓心脉宁片抗动脉粥样硬化的可能成分及作用机制，为未来的研究提供了一定线索。然而本研究亦存在一定的不足之处，由于目前中药成分靶标预测算法的局限性，导致BATMAN-TCM数据库不一定能全面预测中药成分的相关靶标，靶基因预测的局限性会影响本研究对血栓心脉宁片有效成分的全面认识，另无法预测不同药物组分的相互作用、无法量化药物的药理作用，而且不能预测尚未发现的抗动脉粥样硬化机制。本研究基于网络药理学分析发现，血栓心脉宁片可能通过抑制炎症反应、调节糖脂代谢和信号转导等通路，发挥抗动脉粥样硬化作用，为此药物的后续物质基础研究和分子作用机制的基础研究提供了一定可参考的理论基础。未来可针对各药物中含量较高且药理活性显著的已知成分进行深入研究，期待能在后续的基础研究中对预测的靶标基因和通路进行验证，深入探索血栓心脉宁片抗动脉粥样硬化机制。