免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常综合征家系永生化淋巴细胞系的建立

刘静，王佳，马金海

免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常（ immunodeficiency,centromeric instability and facial anomalies，ICF）综合征是一种极其罕见的常染色体隐性遗传疾病[1]，截至 2019年全世界范围内仅有 70 多例报道[2]，因不易得到临床血样标本，极大限制了对该病的长期深入研究[3]。利用 EB 病毒转染技术，建立永生化淋巴细胞系，可以保存家系成员完整的基因组，为今后长期研究提供珍贵的材料[4]。本研究利用 EB 病毒转染 ICF 综合征家系外周血淋巴细胞，为原发性免疫缺陷病患者建立永生化细胞系提供可行性依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 细胞和耗材 胎牛血清购自美国 Hyclone公司；淋巴细胞分离液、青霉素/链霉素、环孢素 A（CyA）、丁酸钠和植物凝集素均购自美国 Sigma公司；RPMI1640 培养基购自美国 Gibco 公司；B95-8 细胞由卡罗林斯卡医学院惠赠。

1.1.2 主要仪器 超净工作台购自苏州市洁净技术研究所；CO2恒温培养箱购自美国 Shellba 公司；-80 ℃ 超低温冰箱购自日本 Sanyo 公司；24、96 孔细胞培养板、25 cm2一次性培养瓶、冻存管均购自美国 Costar 公司；离心机购自上海安亭科学仪器厂；FACSAria II 流式细胞分选仪购自美国BD 公司。

1.1.3 样本 2 岁女孩，因反复感染 1年余就诊，体格检查发现患儿面部发育异常（低耳位、眼距宽），辅助检查免疫球蛋白 IgG、IgM、IgA 均低于正常，T 细胞数量正常，基因检测 CDCA7 基因复合杂合突变（c.974_975del p.Thr325Arg fs ter 17），确诊为免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常综合征。患儿为家系中先证者，其父母及姐姐无临床症状。

1.2 方法

1.2.1 EB 病毒悬液的制备 将 B95-8 冻存细胞复苏后重悬于 5 ml 完全培养液中（RPMIl640 中添加 20% 胎牛血清、链霉素/青霉素），移至 24 孔培养板，每孔 2 ml，置于 5% CO2、37 ℃ 条件下，当细胞浓度达到 0.5×106个/ml，加入浓度为20 ng/ml 的佛波酯（TPA）200 ng、3 mmol/L 的丁酸钠 0.6 mmol，室温培养 6 h 后用完全培养液洗3 次，3500 r/min 离心 10 min，弃上清，在 10% FBS培养液中以 0.75×106个/ml 浓度重悬，10～14 d离心含有病毒的培养液后，使用 0.8 μm 滤膜过滤，上清液即为 EB 病毒液，4 ℃ 保存备用。

1.2.2 ICF 综合征家系外周血单个核细胞的分离 取 ICF 综合征家系（患儿、父亲、母亲及姐姐）和健康对照共 5 份外周肝素抗凝血各 3 ml，加入 3 ml PBS 等量稀释，缓慢加于 4 ml 淋巴细胞分离液顶部，2000 r/min 室温离心 20 min。将含有单个核细胞的中间层移至新的 15 ml 离心管中，重悬在 PBS 中，1500 r/min 室温离心 10 min，小心弃去上清液，加入 3 ml ACK 使红细胞破裂，室温下静置 3 min。加入 PBS，1500 r/min 室温离心10 min，弃去上清。加入 15 ml 完全培养液，对各个样本进行计数。

1.2.3 EB 病毒转染淋巴细胞系的建立 ICF 综合征家系 4 个样本和 1 个健康对照样本单个核细胞，加入 1 ml EB 病毒后重悬于 15 ml 离心管中，每个离心管中的单个核细胞数量至少大于4.9×105个，放置在 5% CO2、37 ℃ 培养箱 1.5 h，1500 r/min 离心 10 min 后弃上清，加入 1 ml 完全培养液重悬，同时加入 20% FBS 及 0.5 μg/ml 环孢素 A，置于 96 孔板，每隔一周半量换液，且每次培养基中均加入浓度为 0.5 μg/ml 的环孢素 A。见淋巴细胞增大且形成大小不等的多个细胞团时，以 1:3 传代至 24 孔培养板，进而转至 25 cm2培养瓶中传代培养。1 个月后可见较黑细胞团，打散后很快再次形成团块状，即获得稳定的淋巴细胞系。

1.2.4 转染细胞的冻存与复苏 细胞冻存时将转化成功的细胞系（细胞计数 ＞ 2×106个），1500 r/min离心 10 min，弃上清液，在 500 μl 完全培养液中重悬，加 500 μl 细胞冻存液（10% DMSO 的胎牛血清 + 40% FBS）， 混匀后分装于冻存管，置-80% 冰箱过夜，次日转入液氮中保存。冻存时行半量冻存，其余继续培养传代。

冻存细胞复苏时，将冻存管取出后迅速放置5% CO2、37 ℃ 培养箱 2 min，融化后用 RPMI1640清洗，1500 r/min 离心 10 min，弃上清，加完全培养液进行培养，取 10 μl 用台盼蓝检测，细胞活性应大于 90%。

2 结果

2.1 利用 B95-8 细胞系制备 EB 病毒

B95-8 细胞系为猴的淋巴瘤细胞，半贴壁生长，可见杆状及椭圆形细胞，当细胞在视野中占2/3，且多为杆状细胞，可加入 TPA 及丁酸钠，促使细胞裂解，释放 EB 病毒，此时可见少量大小不一的细胞团块，大概 10～14 d 培养液中所有细胞死亡（图1）。

图1 倒置显微镜观察 B95-8 细胞系制备 EB 病毒（A：B95-8 细胞；B：加入 TPA 及丁酸钠后细胞裂解，释放 EB 病毒；C：10～14 d 后培养液中所有细胞已死亡，可见细胞碎片）Figure 1 B95-8 cell observation during the EBV preparation (A:B95-8 cells; B:After adding TPA and sodium butyrate,the cells lysed and released the EBV; C:Ten to fourteen days later,all the cells were dead in the media,and the cell fragments were visible)

2.2 采用流式细胞技术检测 ICF 综合征家系 B细胞表达水平

该家系中患儿及其母亲初始 B 细胞占总 B细胞比例较其他家庭成员及正常对照有下降。而患儿记忆 B 细胞在分化成熟阶段出现障碍，比例明显低于健康对照，但有大量的浆母细胞，故可行 EB病毒转染技术，建立 ICF 综合征家系永生化淋巴细胞系（图2）。

图2 正常对照者、患儿父亲、患儿母亲、患儿姐姐、患儿的 B 细胞表达水平Figure 2 The expression of B cells from normal control,the patient's father,mother,sister and the patient

2.3 建立 EB 病毒转染 ICF 综合征家系永生化淋巴细胞系

根据流式细胞技术对 ICF 家系的 B 细胞分群分析的结果，选取不同浓度的细胞数进行 EB 病毒转染，24 孔培养板可见细胞多于中央聚集，而在 96 孔培养板中细胞多于周围壁聚集，B 细胞体积增大，变为圆形、椭圆形，在光学显微镜下很难与 T 细胞辨别。每周半量换培养液，大概 2 周后T 细胞大量死亡，视野可见少量散在分布的圆形细胞，多数细胞逐渐聚集，成小团或簇状，细胞增殖旺盛，可转移至培养瓶中，细胞很快形成团簇状生长，4～5 周后逐渐变大变黑，可传代培养，表明成功获得永生细胞系（图3）。

图3 转染 4 周后倒置显微镜下永生化淋巴细胞的形态（× 100）Figure 3 Morphology of immortalized lymphocytes after four weeks under inverted microscope (× 100)

3 讨论

ICF 综合征是一类常染色体隐性遗传的疾病，临床上极其罕见，而此类患者不宜反复抽取血样，也有患者因免疫缺陷重症感染离世，这些宝贵的具有特定生物学性状的资料也随之丢失，严重影响我国对于罕见病发病机制的长期深入研究，导致临床医生对此类疾病的认识不足，易造成误诊漏诊[5]。而利用 EB 病毒转染外周血淋巴细胞，使其成为一种能连续分裂、体外可培养、永存的淋巴细胞系，保存家系成员完整的基因组，可为后期深入长期研究提供保障[6]，也为原发性免疫缺陷病患者建立永生化细胞系提供可行性依据，对现有技术不能明确诊断以及研究的珍贵样本，长期保存遗传信息以便进行回顾性研究具有重大意义[7]。

利用 EB 病毒转染技术得到永生化淋巴细胞的报道始见于 1985年[8]。目前国内进行的实验多为 EB 病毒转染健康细胞后得到永生淋巴样细胞系，对正常人体淋巴细胞体外分子生物学特征研究起到推动作用，具有重要意义[9]。ICF 综合征这类罕见疾病存在免疫缺陷，B 细胞增殖、活化、分化均存在不同程度的缺陷，转染过程困难重重。本研究针对原发性免疫缺陷病，使用流式细胞仪重点对淋巴细胞进行分群分析，使用最佳数量的外周血单个核细胞与 EB 病毒进行转染，并对转染后的永生化细胞生长周期进行预判，在不同时期选择换培养液或收集细胞，调整细胞浓度，最终成功地在 ICF家系获得永生化淋巴细胞系。

正常人群外周血单个核细胞的提取技术已经很成熟，但对于免疫缺陷的患者，需采用流式细胞仪检测外周血中淋巴细胞亚群比例[10]。ICF 家系中，初始 B 细胞比例基本正常，而患者记忆 B 细胞比例明显低于健康对照，该患者的记忆 B 细胞在分化成熟阶段出现障碍，但有大量的浆母细胞。根据流式细胞仪的结果，我们选取不同细胞浓度进行 EB 病毒转染，根据细胞生长情况及培养液颜色进行半量换液，且在换液时注意勿将移液器触及培养瓶底部，培养液中加入 CyA（终浓度 0.5 μg/ml），以抑制可能残留的 T 细胞活性。一个月后成功获得永生化淋巴细胞系，细胞增殖活跃，可以不停传代培养。同时我们对比 EB 病毒转染冻存外周血单个核细胞和新鲜外周血单个核细胞，所需血量无明显差别，操作相同，转化效率、建系周期基本一致，在操作时需注意 EB 病毒转染冻存外周血单个核细胞起初 1 小时可能会有大量黏滞的液体，为细胞破裂大量 DNA 释放后的产物，无需反复吹打，如果病人 B 细胞总数较少，可将黏滞的液体另转移至 96 孔培养板中继续培养。

对于冻存 EB 病毒转染后的 ICF 家系永生淋巴细胞系，10% DMSO 作为渗透性冷冻保护剂，对淋巴细胞起到很好的冷冻保护作用[11]。复苏后的细胞活性在 90% 以上，为 ICF 综合征等罕见病体外长期研究提供材料。对于目前无法明确病因和基因诊断的疾病建立永生化细胞系保存细胞基因组，保存罕见疾病珍贵的遗传资料，以期日后进一步研究，这个方法的建立对该病发病机制的免疫学研究具有重要意义。