莽草酸激酶作为抗结核分枝杆菌药物发现靶标的研究进展

李蒙，代晓伟，卞聪，朱小红，司书毅，李妍，姜威

近年来，随着结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）单药耐药（SDR-TB）、多药耐药（MDR-TB）和广泛耐药（XDR-TB）菌株的不断出现和蔓延，使得传统抗结核药物的临床有效率不断下降，结核病也因此再次成为严重危害人类健康和公共安全的传染性疾病[1-5]。研发新型抗结核药物，解决结核病治疗所面临的难题成为控制结核病疫情的当务之急。针对传统药物进行结构优化或是通过对现有药物进行组合获得新的组剂，相对而言是获得抗结核新药的捷径，由此获得的新药在特定情况下可提高治疗效率，但由于此类药物在化学结构和作用机制上与传统药物无明显差异，导致其不能有效地避开 MTB 的耐药机制，对高水平耐药结核菌无效，仍然不能有效地治疗耐药结核病[6-9]。因此发现新的药物靶标进而发现新的先导药物成为抗结核药物研发的重要方向。

莽草酸途径是细菌、真菌、藻类、高等植物等合成必需芳香族氨基酸的必需途径，该途径合成的分支酸是合成色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及叶酸、泛酸和奎宁酸等芳香型化合物的前体物质[10]。人体内并不存在莽草酸途径中各个酶的编码基因，而且目前尚未有以莽草酸途径为靶标的抗结核药物应用于临床，以莽草酸途径的关键酶为靶标的抗结核药物可能具有有效、低毒且无交叉耐药的优势，因此莽草酸途径中的关键酶作为新型抗结核药物靶标引起了研究者的广泛关注[11-15]。目前已经发现多个以莽草酸途径中的关键酶为靶标的具有抗结核活性的药物，其中多数为莽草酸激酶（shikimate kinase，SK）抑制剂，该激酶被认为是莽草酸途径中最具有潜力的药物研发靶标[16]。本文就近年来结核分枝杆菌莽草酸激酶（MtSK）结构和功能相关研究及其抑制剂的发现等方面作简要综述，为新型抗结核药物的研发提供参考。

1 MtSK 结构和功能

MtSK 蛋白分子量为 18.58 kD，由aroK基因（Rv2539c）编码。aroK基因缺失导致 MTB 无法生长，当回补外源性的aroK基因时，突变株得以存活，证明 MtSK 是维持MTB 生长的必需蛋白[17]。在莽草酸途径中，MtSK 催化第五步反应，它以 ATP 为高能磷酸供体，使磷酰基团从 ATP转移至莽草酸，从而生成 3-磷酸莽草酸并释放出 1 个ADP 分子[18-19]（图1）。

图1 MtSK 催化反应

MtSK 属于核苷单磷酸（NMP）激酶家族，MtSK 核心是五股平行的 β-片层结构，两侧有八个 α-螺旋结构[20]。MtSK 包含 NMP 激酶家族共有的三个功能性结构域：①核心结构域，包含五股平行的 β-片层结构和形成核苷酸结合位点的 phosphate-binding loop（P 环，G9-S17，也称为Walker A-motif）；②LID 结构域（G112-D124 残基），它封闭在活性位点上，负责打开和关闭催化位点，允许酶与底物和产物相互作用，并具有对 ATP 结合至关重要的残基；③NMP 结合域（T33-E61，也称为 SB 结构域），其功能是识别和结合莽草酸[21-22]（图2）。最近，基于对配体结合的综合动态分析，有人提出 MtSK 由四个结构域组成：①ESB结构域（扩展 SB；残基 32-93）；②核苷酸结合（NB）结构域，负责构成核苷酸结合的柔性区域，包括 P 环、AB 环（残基 148-155）和 101-110 的片段；③LID 结构域（残基 112-124）；④还原核心（RC）结构域，它覆盖 NB 结构域和 ESB 部分结构域（残基 62-93）[18]。RC 结构域是酶最刚性的部分，而 LID 和 NB 结构域是最柔性的部分[21-23]。

图2 MtSK 晶体结构

莽草酸的羧基端与 R58 和 R136 结合，3-羟基端与D34 和 G80 结合，而 2-羟基与 D34 相结合[24]。Mg2+和ADP 与 P 环、LID 结构域和腺嘌呤结合环中残基相互作用。MtSK 在底物结合时会发生很大的构象变化，其中 SB和 LID 结构域的结构变化最大。在催化过程中，ATP 首先与酶结合，并诱导 LID 结构域在活性位点上的大幅度移动。之后，莽草酸底物与活性位点结合，LID 结构域在活性位点上方闭合，使 Arg110 和 Arg117 分别进入 ATP 和SB 结构域。莽草酸通过 Arg136 和 Asp34 的侧链和水网直接和间接结合活性位点[21,25]。

2 MtSK 抑制剂

随着 MtSK 晶体结构的解析和酶活性检测方法的建立，建立在虚拟筛选和底物类似物设计、针对 MtSK 三个重要的功能结构域开展的酶抑制剂的筛选也多有报道。目前也已经发现多个 MtSK 抑制剂，并且均表现出良好的抗结核活性。

2.1 基于 MtSK 晶体结构的抑制剂的虚拟筛选和底物类似物的设计

早在 2008年，Segura-Cabrera 和 Rodríguez-Pérez[26]应用 eHiTS 6.2 软件包模拟 MtSK 的莽草酸结合位点建立虚拟筛选方法，与来自 FAF-Drugs 数据库的化合物进行对接，以莽草酸和竞争性抑制剂 6-S-氟代莽草酸作为阳性药物，获得 644 个得分高于莽草酸底物的化合物，其中 axce1得分最高。得分高的典型化合物具有巯基、三唑或四唑杂环芳烃结构。但是此研究仅限于化合物与晶体结构的虚拟对接和成药性虚拟评价，并未有酶抑制活性和抗结核活性的检测。

2010 年，Kumar 等[27]基于 MtSK 开口和闭合晶体结构进行了莽草酸和 ADP 结合位点的关键氨基酸分析，并且基于此进行了二肽的合成。进一步对接分析发现最合适的二肽抑制剂是 NH3-Arg-Asp-COO（RD），其与 MtSK 的开口和闭口结构以相似的方式结合，并且占据了几乎所有可用于结合的口袋空间。RD 与 MtSK 结合的 Kd 值为 5.49 nm，比底物莽草酸的 Kd 值高出约 8000 倍，比 axce1 的 Kd值高 10 倍，因此，二肽 RD 有望成为开发抗结核药物的先导化合物。Vianna 和 de Azevedo[28]应用 MolDOCK 虚拟筛选 MtSK 抑制剂，对 ZINK 数据库中的 4580 个化合物中选择打分在前 20 名的化合物，星形孢菌素是其中之一。进一步的结合位点分析发现这些化合物与激酶的结合主要是在莽草酸结合位点。

基于结构的药物虚拟筛选评分方法的命中率相对较低，单一靶标和位点的结合打分标准是原因之一，Core Site-Moiety Maps 筛选方法的重点是在靶蛋白共享保守结合位点的情况下，发现多个药效团，提供有用的指标，以提高筛选的准确性。Hsu 等[29]采用 Core Site-Moiety Maps 方法筛选 MtSK 和 HpSK 抑制剂，发现 6 个新的 IC50低于10 μmol/L 的化合物 NSC45611、NSC162535、NSC45612、NSC45174、NSC45547 和 NSC45609，这些化合物多为 ATP和莽草酸竞争性抑制剂。同时，从 65 种已有的激酶抑制剂发现两个具有抑制作用的化合物 AG538 和 GW5074。酶动力学分析表明，NSC45611、NSC162535 和 NSC45612 是ATP 和莽草酸的双重竞争性抑制剂，AG538 是 ATP 的竞争性抑制剂。利用该方法，成功地发现了六种新的 HpSK 和MtSK 抑制剂（8.0 mmol/L）。65 个激酶抑制剂中的两个也被发现同时抑制 HpSK 和 MtSK 活性。NSC45611、NSC162535 和 NSC45612 是 ATP 和莽草酸的竞争性抑制剂，这表明它们属于一类新的莽草酸激酶抑制剂。

2013 年，Blanco 等[30]基于结构和分子动力学（MD）模拟研究，分析了 MtSK/ATP/莽草酸以及 MtSK/ADP/三磷酸莽草酸结合过程中的酶的构象变化以及与底物的相互作用关键位点，在阐明酶与底物或者产物结合的决定性因素和酶催化转化所必需的关键酶运动的基础上，设计了莽草酸的结构类似物。类似物包括共形限制莽草酸类似物、羟基衍生物和氨基莽草酸，酶抑制活性研究发现这些类似物都是竞争性可逆的酶抑制剂，Ki 值在 46～1050 μmol/L。构效关系和 MD 模拟研究表明，由于 SK 酶被设计成能够识别天然底物热力学上不太稳定的构象，因此那些能够保持酶所识别构象并导致 LID 和（或）SB 结构域的流动性降低的化合物是开发酶抑制剂的一个很好的策略。

与前面的单一筛选方法不同，2016年，Mehra 等[31]利用已报道的 MtSK 抑制剂的数据进行电子相似性搜索和药效团建模双重筛选，在从 ChemBridge 库 20000 个市售化合物的类似药物中筛选到 15 个化合物进行进一步的酶活评价，其中两个苯并噻唑衍生物 5489375 和 5311863 表现出较好的酶抑制活性，IC50分别为（10.69 ± 0.9）μmol/L和（46.22 ± 1.2）μmol/L。对 5489375 深入研究，发现它既不是 ATP 竞争性抑制剂，也不是莽草酸竞争性抑制剂，通过对 5489375 进行分子对接和 MD 模拟分析，发现它可能是结合在 MtSK 的变构位点，抑制了催化产物的释放，使得激酶无法恢复催化构象，这种机制的研究为 MtSK 抑制剂的虚拟筛选提供了一种新的思路。

2.2 基于 MtSK 活性的抑制剂的发现

在 MtSK 催化过程中，通过检测 ADP 和 3-磷酸莽草酸的形成或者检测 ATP 的消耗都可以反映 MtSK 的催化活性。丙酮酸激酶（PK）能使 ADP 和磷酸烯醇式丙酮酸反应生成 ATP 和丙酮酸，后者能够在 L-乳酸脱氢酶和 NADH 作用下生成 L-乳酸和 NAD+，在OD340nm检测 NADH 的减少可以间接地反映 ADP 的生成量。基于此，Rajput 等[32]建立了 MtSK 的检测方法。通过对来自ChemBridge 数据库的 1000 个具有抗结核杆菌活性的化合物进行酶抑制活性评价，最终发现了 5 个 IC50低于10 μmol/L 的化合物，分别是硫代巴比妥酸盐、萘醌、噻唑乙腈、查尔酮和噻唑烷二酮。这些化合物都是 ATP 竞争性抑制剂，分子对接发现它们结合在 ATP 结合位点，Arg110是关键作用的氨基酸。5 个化合物对标准株 H37Rv 的 MIC在 4～16 μg/ml，对 MDR 菌株也有一定的抑制活性。

2014 年，Zaher 等[33]通过 LC-MS 检测 3-磷酸莽草酸生成的方法对 404 个具有抗结核活性的化合物进行 MtSK抑制活性的检测，结果发现 14 个噁二唑酰胺和2-氨基苯并噻唑类化合物，它们的 IC50在 1.94～36.04 μmol/L，细胞毒性小，SI 指数均在 10 以上。但是在 2017年，Alturki等[34]对这 14 个化合物进行分析，发现它们是 MtSK 的非特异性抑制剂，这些化合物在溶液中容易形成聚集体，这可能是它们酶抑制活性和体内活性的原因。它们的抗菌活性可能与其他靶标相关，而不仅仅是 MtSK 抑制。

Mulabagal 和 Calderón[35]使用超滤液相色谱/质谱（UF-LC/MS）检测化合物与 MtSK 结合活性，液质联用（LC/MS）检测化合物对 MtSK 的抑制活性，评估了 4 个化合物对 MtSK 蛋白的抑制作用，其中 3 个化合物是吡唑啉酮类，一个是星形孢菌素，发现 4 个化合物与 MtSK 能够特异性结合，EC50在 0.07～0.3 μmol/L。

王霞等[36]应用 Kinase-Glo®Plus Luminescent Kinase Assay 试剂盒建立了 MtSK 激酶抑制剂的筛选方法，通过检测反应体系中 ATP 的消耗量来反映 MtSK 的酶活性。该方法结合耻垢分枝杆菌表型筛选发现了 1 个对 MtSK蛋白有抑制作用的化合物 IMB-T5297，该化合物的 IC50为1.745 μg/ml，与 MtSK 的Kd 值为 21.51 μmol/L，对哺乳动物细胞的毒性很低，但是 IMB-T5297 对标准株 H37Rv、临床分离耐药株 XDR 的抑制活性也较低（MIC 分别为49.723 和 47.754 μg/ml）。

2.3 其他 MtSK 激酶抑制剂

除了有目的的 MtSK 抑制剂的发现，在具有抗结核活性的药物机制研究中也发现多个具有 MtSK 抑制活性的化合物。

多酚类化合物是具有多种生物活性的一类天然产物，不同来源的多酚类化合物也被发现具有抗分枝杆菌的活性。在机制研究中，Pandey 等[37]发现多酚类化合物卡马拉素具有MtSK 的抑制活性。该化合物对结核分枝杆菌的 IC50在 9～12 μmol/L，而 MtSK 的缺陷株则表现出对卡马拉素的拮抗。体外酶活检测发现，在 1.56～100 μmol/L 的浓度下，卡马拉素表现出对 MtSK 的强抑制活性，在 1.56 μmol/L浓度下，抑制率高于 50%，在 50 μmol/L 浓度下，抑制率接近 100%。分子对接显示 MtSK 与卡马拉素的结合能为-8.8 kcal/mol，与 Ser16、Thr17 和 Arg110 表现出极性相互作用。卡马拉素是 PKC-σ 抑制剂，但是在其作用 2 小时后，PKC-σ 由最初的低表达明显上升，而卡马拉素依旧能够抑制结核杆菌的生长，因此认为卡马拉素的生长抑制活性是两个酶抑制的叠加结果。所有这些研究都表明 MtSK是卡马拉素抗结核活性的重要靶标。

生物碱 manzamine 是一类分离自印度太平洋海绵的化合物，具有广泛的生物活性。其中 manzamine A 是第一个被分离出来的该类化合物，它在体外表现出良好的抗结核活性，对结核分枝杆菌 H37Rv 的 MIC50值为 1.5 μg/ml，与利福平相当。Simithy 等[38]在该类化合物抗结核机制的研究中，应用 LC-MS 的检测方法从 26 个衍生物中发现了6 个化合物具有 MtSK 抑制活性，包括 manzamine A、8-hydroxymanzamine A、manzamine E、manzamine F、6-deoxymanzamine X 和 6-cyclohexamidomanzamine A。初步动力学评估表明，这 6 个化合物都是混合的非竞争性酶抑制剂，其中 6-cyclohexamidomanzamine A 对所有形式的MtSK（游离酶、每种酶-底物二元复合物和酶-底物三元复合物）的 Ki 值最低。6-cyclohexamidomanzamine A 与MtSK 的对接模拟预测了该化合物与 MtSK 两种可能的结合模式，6-环己酰胺部分占据莽草酸结合位点，而在另一个位置则与共结晶的 ADP 重叠。此外，manzamine 可抑制GSK-3β 的活性，并且无细胞毒性。GSK-3β 所调控的通路与结核分枝杆菌逃逸机体免疫相关，因此这类化合物有望用于进一步的研究，从而开发出针对结核分枝杆菌病原体的新候选药物，对于 6-cyclohexamidomanzamine A 尤其如此。

Ilimaquinone（IQ）是分离自红海海绵的萜烯醌类化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性。Simithy 等[39]发现 IQ 能够抑制 MtSK 的活性，并呈浓度和时间依赖性，表观速率常数 Kobs 呈线性增加。在酶反应体系中加入预先孵育的 IQ 与 MtSK，结果发现比后加入IQ 产生的抑制率要高，这一结果说明 IQ 所引起的酶抑制活性应该是缓慢的一步且不可逆失活，二阶速率常数（kinact）大约是 60 L/(mol·s)。完整的 MtSK 的质谱验证支持 IQ 与MtSK 结合的 Michael 加成机制，而苏氨酸和丝氨酸残基是 IQ 依赖衍生化的主要靶点，包括 S77、T111 和 S44。IQ 也能衍生和灭活乳酸脱氢酶，但是不能结合丙酮酸激酶（PK）或结核分枝杆菌 KatG（MtKatG），因为四种酶都有大量的丝氨酸和苏氨酸残基，但是 IQ 的抑制活性却并不相同，IQ 对 MtSK 的抑制也没有十分的特异性，说明 IQ 也具有其他的作用靶位，这限制了 IQ 作为特定靶标抗菌药物先导化合物的应用。

Sutherlandia frutescens 是南非传统的中草药，可用于结核病的治疗。Masoko 等[40]从中提取的多个组分具有抗结核活性和 MtSK 抑制活性，其中纯化后得到的 α-亚麻酸具有更强的 MtSK 抑制活性，IC50为 0.1 μg/ml。

3 展望

MtSK 蛋白晶体结构的解析使得虚拟筛选成为可能，最初的抑制剂多是通过此方法得到。虽然虚拟筛选得到的化合物多未有后续的酶活性和抗结核活性的报道，提示这种筛选方法的局限性，但是在虚拟筛选研究中，对 MtSK 催化过程中的构象变化、活性位点和关键氨基酸有了更为深刻的认识，为基于结构的抑制剂的设计奠定了基础，随着计算机虚拟对接技术的发展，针对特定位点的化合物的设计将会推动MtSK 抑制剂的发现。

因为酶活性方法的建立，基于酶活性的抑制剂的筛选近几年来多有报道，已有的抗结核活性的化合物也发现具有MtSK 抑制活性。但是不管是 LC-MS 的方法，还是基于ADP 或 ATP 检测的方法，因为检测仪器或者检测过程的繁琐，很难真正实现高通量筛选，而仅仅是配合表型筛选进行的小范围筛选，因此改进酶活检测方法对于实现高通量的MtSK 抑制剂筛选十分重要。

总之，目前发现的多个 MtSK 抑制剂具有抗结核活性，并且多个具有抗结核活性的化合物的抗结核机制也与MtSK 抑制相关，这些研究证明 MtSK 作为药物发现靶标依然具有良好的前景；目前尚未有 MtSK 抑制剂应用于临床研究，针对该靶标的先导化合物也不容易产生交叉耐药，因此进一步研究 MtSK 抑制剂的高通量筛选方法，进而发现具有抗结核活性的先导化合物依然具有重要的意义。