药源性眼损伤快速评价的斑马鱼模型

张苗青，胡昌勤，张靖溥

滴眼液是直接用于眼部发挥治疗眼部疾病的无菌制剂。为更好地保护滴眼液，防止在使用和保存过程中被微生物污染，多种滴眼液中均加有防腐剂。防腐剂会对眼部产生刺激，长期用药会产生局部毒副作用[1]。苯扎溴铵和羟苯乙酯为滴眼液中最常用的防腐剂。苯扎溴铵是由溴化二甲基苄基烃铵同系物所组成的混合物，广泛用作抑菌剂[2]。羟苯乙酯，化学名为对羟基苯甲酸乙酯，是尼泊金酯类防腐剂，具有广谱的抑菌作用。有研究表明，长期使用含苯扎溴铵或羟苯乙酯的滴眼液对眼部有不同程度的损伤，导致眼部不适、过敏、纤维化、结膜鳞状化、角膜厚度变化以及炎症等症状[3-6]。至今，有效的快速评价化合物致眼损伤的体内模型尚未见报道。

近年来，斑马鱼凭借其繁殖周期短，使用药物量少、遗传水平与人类相似、个体小、胚胎透明、便于显微操作等优势，被广泛用于药物筛选和安全性评价的疾病模型。斑马鱼的视觉系统与包括人类在内的其他脊椎动物非常相似，例如其视网膜和晶状体的形态和结构，以及其在受精后第5 天（days post fertilization，dpf）后就具有视觉功能，因此斑马鱼眼睛可作为较好的视觉模型，受到视觉科学研究领域的广泛关注[7-8]。

本研究以苯扎溴铵和羟苯乙酯为探针药物，建立药源性斑马鱼眼损伤模型，并探讨苯扎溴铵和羟苯乙酯诱导斑马鱼眼损伤的作用机制。以期为评价这两类化合物类似物的眼毒性提供理论依据和评价参照标准，并为快速评价化合物的眼毒性提供体内模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 斑马鱼野生型 AB 系，饲养温度为（28.5 ± 1）℃，光照条件为 14 h 光照/10 h 黑暗，饲养液的电导率为 500～550 μS/cm。斑马鱼幼体的获得：取野生型斑马鱼成鱼雌雄各两条交配，收集受精卵，清洗后，挑选表型正常的受精卵养殖在斑马鱼饲养液中，待发育至 3 dpf 用于后续实验。本实验程序符合中国医学科学院医药生物技术研究所的动物实验伦理规则，并获得所实验动物管理委员会的准许。

1.1.2 试剂 苯扎溴铵（浓度为 10.9 mg/ml）和羟苯乙酯标准品（纯度为 99.9 %）来自中国食品药品检定研究院；4% 多聚甲醛（PFA）购自北京普利莱基因技术有限公司；pGEM-T 载体和 M-MLV反转录酶购自美国 Promega 公司；地高辛 RNA标记试剂盒购自瑞士 Roche 公司；Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 LD5和 LD50测定 随机选取发育正常的3 dpf 斑马鱼，每组各 30 条。给予不同浓度的苯扎溴铵（10、20、40、60、80、100 和 120 μg/ml）和不同浓度的羟苯乙酯（50、100、200、400、600、800、1000 和 1200 μg/ml），以 0.1% DMSO 为对照组。给药 72 h 后，统计每组斑马鱼死亡情况，计算死亡率（%），用 GraphPad Prism 8.0 统计学软件绘制“致死率-浓度”效应曲线，用 Bliss 法计算苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼毒性的 LD5和LD50值。

1.2.2 活体观察斑马鱼眼损伤 随机选取发育正常的 3 dpf 斑马鱼，每组各 20 条，以 0.1% DMSO为对照组，给药组置于不同浓度的苯扎溴铵（4 和10 μg/ml）和羟苯乙酯（10 和 50 μg/ml）药液中，28.5 ℃ 培养 72 h，每 24 小时换液一次，在体式显微镜下观察斑马鱼幼鱼眼部形态变化并拍照记录。利用 Image J 软件测量虹膜带宽和瞳孔直径，并计算两者的比值。

1.2.3 行为学检测 取野生型斑马鱼 3 dpf 幼鱼，以未处理组为对照，分别给予不同浓度的苯扎溴铵和羟苯乙酯，72 h 后，清洗 3 遍，置于 96 孔板中，每孔一条鱼，每组 12 条鱼，放入斑马鱼行为轨迹跟踪系统（斑马鱼行为检测仪）中静置10 min，黑暗中 5 min 后立即给予光刺激 20 s，每20 s 记录一次数据，以此循环重复 3 次，计算黑暗中第280～300 秒的平均速度、光照 20 s 的平均速度，以及对应的运动距离。并跟踪记录各处理组幼鱼在黑暗条件下最后 20 s（第280～300 秒）和光照条件下 20 s 的游泳轨迹。

1.2.4 RT-PCR 方法检测眼部发育相关基因的转录水平 取野生型斑马鱼 3 dpf 幼鱼给予不同浓度的苯扎溴铵（2、4 和 10 μg/ml）和羟苯乙酯（5、10 和 50 μg/ml）药液，以 0.1% DMSO 为对照组，72 h 后收集各组斑马鱼幼鱼。Trizol 法提取总 RNA，利用 M-MLV 反转录酶反转录为cDNA，以 cDNA 为模板进行 RT-PCR。以β-actin为内参对照，以对照组为外对照，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪拍照记录，用 Gel-pro Analyzer 软件对电泳图进行灰度扫描分析，得到条带的灰度值，每组实验平行重复 3 次。所用引物序列如表1 所示。

表1 RT-PCR 引物Table 1 Primers used in the RT-PCR analysis of different gene markers

1.2.5 斑马鱼整体原位杂交 将靶基因six3和pitx2编码区片段克隆至 pGEM-T 载体上，以此作为模板，按照地高辛标记 RNA 试剂盒说明书，制备反义 RNA 探针。收集药物处理后的斑马鱼幼鱼（6 dpf），4% 多聚甲醛固定过夜，原位杂交程序按照文献[9]进行。显微镜下对幼体眼睛拍照。

1.3 统计学处理

利用 GraphPad Prism 8.0 软件进行分析，所有数据以三个独立实验的±s表示。两组间比较采用t检验，P ＜0.05认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼幼鱼的整体毒性

野生型斑马鱼 3 dpf 幼鱼分别置于不同浓度的苯扎溴铵溶液和羟苯乙酯溶液中培养 3 d，将每组斑马鱼幼鱼死亡数计数，绘制两种化合物的致死率-浓度曲线（图1），通过计算得出苯扎溴铵对斑马鱼幼鱼的 LD5和 LD50，分别为 13.5 μg/ml和 37.5 μg/ml，羟苯乙酯的 LD5和 LD50分别为53.6 μg/ml 和 226.3 μg/ml。以小于 1/3 LD50和小于 LD5值为给药浓度依据，确定后续实验苯扎溴铵的给药浓度为 2、4 和 10 μg/ml，羟苯乙酯的给药浓度为 5、10 和 50 μg/ml。根据两种化合物的LD50值，苯扎溴铵对斑马鱼幼鱼的整体毒性大于羟苯乙酯。

图1 苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼幼鱼的致死率Figure 1 Dose-mortality curve of benzalkonium bromide and ethylparaben

2.2 苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼的眼损伤

野生型斑马鱼 3 dpf 幼鱼分别置于上述实验确定的苯扎溴铵浓度溶液和羟苯乙酯浓度溶液中，给药 3 d，利用体式显微镜观察眼部表型变化。如图2 所示，与对照组相比，苯扎溴铵和羟苯乙酯均能显著降低虹膜带宽/瞳孔直径的比值，并呈浓度依赖性，且导致虹膜边缘不规则，这一结果与人类虹膜括约肌撕裂或断裂症状相似[10]，说明这两种化合物均可造成虹膜损伤。同时，两种化合物均能使幼鱼的眼部有斑块样病变（绿色箭头），主要集中在虹膜和巩膜边缘，由于角膜在显微镜下呈透明状，无法直接观测，根据角膜在眼部的位置（覆盖在虹膜和巩膜邻接上方），我们推测该斑块样病变是发生在角膜上。这一结果与人类的斑点角膜营养缺陷症状（fleck corneal dystrophy，CFD）相似[11]。同时，药物处理组幼鱼眼部的巩膜凸起（白色椭圆），这与人类高度近视后巩膜凸起病变相似[12-13]。该结果还显示苯扎溴铵和羟苯乙酯在相同浓度条件下（10 μg/ml）对斑马鱼眼损伤程度相似。以上结果说明苯扎溴铵和羟苯乙酯均能够诱导斑马鱼幼鱼眼损伤，且病症与人类眼部损伤的某些病症相似。

2.3 苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼幼鱼运动行为的影响

用斑马鱼行为检测仪测量发现对照组中幼鱼在黑暗和光照条件下平均速率和运动总距离无明显差异，而苯扎溴铵和羟苯乙酯处理组中的幼鱼在光照刺激下的平均速率和运动总距离显著性低于黑暗条件下的平均速度和运动总距离。同时，药物处理组幼鱼的平均速度和运动总距离与对照组相比，在黑暗条件下无明显差异，但在光照条件下运动速度和运动总距离呈剂量依赖性降低（图3A、B）。运动轨迹图显示在黑暗条件下，药物处理组中个别斑马鱼的运动轨迹呈现轻度异常，多数未见明显异常，说明这两种化合物对斑马鱼的运动神经和肌组织无明显损伤；在突然的光照刺激条件下，与对照组相比，苯扎溴铵和羟苯乙酯处理组幼鱼呈不规则游动且运动速度和运动距离明显下降（图3C、D），说明给药组幼鱼对光刺激的调节能力降低，有可能是由于药物处理组的斑马鱼眼部虹膜损伤，产生畏光反应。

2.4 苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼眼部发育相关基因表达的影响

为进一步探讨这两种化合物诱导眼损伤的分子机制，用 RT-PCR 检测两种化合物对斑马鱼幼鱼眼部发育相关基因表达水平的影响，例如与光感受器发育相关的crb1[14]、与巩膜发育相关的lumican[15]、与虹膜发育相关的pax6a[16]、与视网膜发育相关的six3[17]、与角膜发育相关的pip5k3和pitx2[18-19]、与晶状体发育相关的bumper[20]。结果表明，随着给药浓度的增加，两种化合物不同程度地抑制crb1、six3、lumican、pax6a、pip5k3和pitx2的转录水平，但对bumper的转录水平无明显影响（图4A、B），表明两种化合物选择性地下调了斑马鱼幼鱼眼发育相关基因的表达。原位杂交实验也验证了苯扎溴铵和羟苯乙酯能抑制six3和pitx2基因在斑马鱼眼部的表达，其表达水平呈剂量依赖性降低（图4C），说明苯扎溴铵和羟苯乙酯可能通过降低一些眼发育相关基因的表达水平，破坏了斑马鱼眼部正常发育，从而导致眼损伤。

图2 苯扎溴铵（A）和羟苯乙酯（B）对斑马鱼幼鱼的眼毒性[活体观察不同浓度的苯扎溴铵和羟苯乙酯处理后斑马鱼幼鱼的眼部表型，包括虹膜带宽（红色箭头）、斑点角膜（绿色箭头）和巩膜凸起（白色椭圆）。其中虹膜带宽与瞳孔直径的比值呈浓度依赖性降低，与 Control 组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，右下角的数字表示每组阳性结果的数量，标尺 = 200 μm]Figure 2 Visual phenotype of eye injury of benzalkonium bromide (A) and ethylparaben (B) in larval zebrafish [Viviperception of the larvae eye phenotype by using light microscopic images,including iris bandwidth (red arrows),fleck corneal (green arrows),and scleral protrusion (white coil).The ratio of iris bandwidth to pupil diameter were decreased in a concentration-dependent manner.*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001 vs Control.The digit on the bottom right corner indicates the number of positive images.Scale bar = 200 μm]

3 讨论

图3 苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼行为学的影响[A：苯扎溴铵和羟苯乙酯对幼鱼在 5 min 黑暗刺激的最后 20 s 和光刺激 20 s 平均速度的统计结果，与黑暗刺激条件下平均速度相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，与对照组光刺激条件下平均速度相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001；B：苯扎溴铵和羟苯乙酯对幼鱼在 5 min 黑暗刺激的最后 20 s 和光刺激 20 s 运动总距离的统计结果，与黑暗刺激条件下运动总距离相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，与对照组光刺激条件下运动总距离相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001；苯扎溴铵和羟苯乙酯对幼鱼在黑暗刺激最后 20 s（C）和光刺激 20 s（D）的运动轨迹的影响]Figure 3 Effect of benzalkonium bromide and ethylparaben on behavior of zebrafish larvae [A:The data show average speed in the last 20 s of the 5 min dark stimulation and in 20 s in light stimulation in benzalkonium bromide and ethylparaben groups.*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 vs average speed in darkness of each group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01,###P ＜ 0.001 vs average speed in light of control group; B:The data show total distance in the last 20 s of the 5 min dark stimulation and in 20 s in light stimulation in benzalkonium bromide and ethylparaben groups,respectively.*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 vs total distance in darkness of each group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01,###P ＜ 0.001 vs total distance in light of control group; Drugs effect on swim behavioral of larvae.Swim behavioral tracks were recorded in the last 20 s of the 5 min dark stimulation (C) and in 20 s in light stimulation (D)]

图4 苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼幼鱼眼发育相关基因表达的影响（A、B：利用 RT-PCR 检测苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼眼发育相关基因 crb1、six3、lumican、pax6a、pip5k3、pitx2 和 bumper 的表达水平的影响，并扫描条带的灰度，做柱状图，与 Control 组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，每组实验重复三次；C：利用原位杂交实验验证调节基因 six3和 pitx2 在斑马鱼眼部的表达水平的变化，右下角的数字表示每组阳性结果的数量，标尺 = 200 μm）Figure 4 The effect of benzalkonium bromide and ethylparaben on expression levels of the selected genes related to eye development in zebrafish larvae (A,B:The expression level of crb1,six3,lumican,pax6a,pip5k3,pitx2 and bumper were determined by using RT-PCR analysis.*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 vs Control group,n = 3; C:The transcription of regulator genes six3 and pitx2 in the eye of zebrafish were detected via the whole-mount in situ hybridization.The digit on the bottom right corner indicates the number of positive images.Scale bar = 200 μm)

眼科疾病是影响生活质量的最常见感官损伤。斑马鱼视觉系统的解剖结构和功能组成与人类相似，视网膜中包含典型的脊椎动物光感受器，并且它们的视觉系统发育迅速。斑马鱼胚胎 3 dpf 发育成幼体、孵化（此时绒毛膜脱落，眼睛裸露），且与视觉有关的结构和视网膜细胞基本发育成熟，细胞的种类及神经细胞的突触连接也基本建立，并开始发挥其部分功能，适于给药。幼体 5 dpf 开始自主游动捕食，视觉系统发挥作用，适于检测其视觉功能。因此，选择 3 dpf 给药，5 dpf 检测视觉相关指标，常用于眼部发育、功能和疾病的研究[8,21]。防腐剂是滴眼液中的主要成分，具有抗菌活性。研究表明长期使用含防腐剂的滴眼液可能会导致眼表损伤[1]。目前，快速评价防腐剂眼损伤的体内模型尚未有报道。目前用于眼部疾病研究的主要模型为大鼠或小鼠模型，其高成本导致这些哺乳动物模型不适用于高通量筛选。近年来，鉴于斑马鱼自身的优势，以斑马鱼为模式动物来研究视觉功能已成为热点，并建立了斑马鱼眼动反应（optokinetic response，OKR）行为模型[22]，该模型主要应用于视觉信息处理[22-23]、神经环路[24]、视觉系统发育[25]以及药物毒理[26]等方面的研究。然而，该模型的使用范围较窄，并且操作繁琐，不适用于大规模的药物筛选和评价。因此，本研究以苯扎溴铵和羟苯乙酯为探针药物，建立了一种快速筛选和评价化合物眼毒性的斑马鱼模型和方法。通过活体表型显微观察，发现苯扎溴铵和羟苯乙酯能导致斑马鱼幼鱼眼部虹膜损伤、角膜斑块样病变以及巩膜凸起样病变，这些表型特征与人类的某些眼疾病症相似。因此，活体观察斑马鱼幼体眼部表型可以作为一种简单、快速、高效的初步评价眼损伤的检测方法。行为学检测发现苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼运动神经和肌肉组织未见明显损伤，其导致幼鱼光反应能力降低，这与哺乳动物的一些畏光行为相似。为进一步探讨苯扎溴铵和羟苯乙酯诱导药源性眼损伤的作用机制，检测了这两种化合物对斑马鱼眼发育相关基因转录水平的影响。根据文献报道，crb1基因与光感受器发育相关，该基因的缺失会导致斑马鱼眼角膜上皮和基质层的发育异常，造成角膜形状异常[14]；lumican基因编码脊椎动物角膜和巩膜中一种主要的硫酸角蛋白多糖，与人类的轴性近视有关，有研究表明该基因被敲低之后会导致斑马鱼巩膜变薄，眼球变大，类似轴性近视[15]；pax6a基因编码转录因子 PAX6，是正常眼发育所必需，能够调节晶状体、角膜和虹膜等的形成，研究表明PAX6 突变与严重的眼部疾病有关，如无虹膜、角膜缘干细胞功能不全，同时，pax6a功能缺失会导致角膜基因调控程序严重紊乱[16]；pip5k3基因编码激酶 PIKfyve，参与磷脂酰肌醇途径，该基因突变后会导致斑点状角膜营养不良症状[18]；pitx2基因调节角膜上皮和内皮基因的表达，该基因的异常表达会导致角膜内皮细胞破裂[19]；six3基因与斑马鱼视觉系统发育相关，在视网膜同一性的建立和维持中发挥关键作用[17,27-28]；bumper基因与斑马鱼眼晶状体发育相关，该基因突变使得晶状体上皮细胞增生和纤维细胞变性，会导致功能性失明[20]。我们对上述基因的表达水平进行了检测，结果显示除了对bumper转录水平无影响外，苯扎溴铵和羟苯乙酯均能显著下调crb1、six3、lumican、pax6a、pip5k3和pitx2的转录水平。进一步选择可调节角膜上皮细胞基因表达和协调视网膜统一性的基因pitx2和six3进行原位杂交实验，也验证了这两种化合物对基因pitx2和six3在幼鱼眼部表达的抑制作用。这些结果说明两种化合物对斑马鱼眼发育相关基因的影响具有选择性，过量的眼部积累可能影响斑马鱼眼部虹膜、巩膜、角膜和视网膜等的正常发育，从而导致眼损伤。

综上，本研究利用斑马鱼作为模式动物评价苯扎溴铵和羟苯乙酯的眼毒性，并初步探讨了其作用机制，这为苯扎溴铵和羟苯乙酯类似物的眼毒性评价提供了基本的判断标准和理论基础。同时，本研究建立了一种快速评价化学药品眼损伤的体内筛选模型和评价方法。

志谢感谢孟杰技师在斑马鱼饲养上提供的帮助。