过量氟对体外培养LS8细胞中炎症因子表达的影响

寇明清,马志军,李珏丹,阮建平

(1陕西省人民医院CT室,西安 710068;2西安市第九医院口腔科;3陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室;4西安交通大学口腔医院综合科;5西安交通大学口腔医院预防科;*通讯作者,E-mail:1009372603@qq.com)

氟牙症是釉质发育期机体摄入过量氟引起的釉质发育不全,主要发生于高氟区,表现为牙釉质颜色改变甚至缺损,影响患者的颜面美观和咀嚼功能,给患者造成严重的心理和生理障碍[1,2],然而,氟牙症目前尚无理想治疗方法。因此,深入探究氟牙症发病机制,为开发筛选有效的氟中毒治疗药物进而解决我国重要的公共卫生与临床治疗问题提供新靶点。

本课题组[3,4]及Suziki等[5,6]的研究表明过量氟主要通过对成釉细胞的细胞毒性作用使釉质矿化受到影响,导致氟牙症发生。过量氟可从多个方面对成釉细胞产生影响,包括蛋白合成、增殖、凋亡、分泌、内吞作用、钙离子转运及自噬[3,5-12],然而对炎症反应的影响目前尚未见报道。本研究用过量氟干预体外培养LS8细胞,观察其对细胞炎症因子的表达影响,为解决我国重要的公共卫生与临床治疗问题提供线索和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

实时定量PCR仪(Agilent Technologies公司,美国),微量核酸蛋白定量仪Nano Drop2000(Thermo Fisher Scientific公司,美国),PCR仪(BIO-RAD公司,美国),蛋白电泳、转印系统(Bio-Rad公司,美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 LS8细胞培养与传代 用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的高糖DMEM培养液,在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养LS8细胞,隔天换新鲜培养基。待细胞融合至培养瓶的70%-80%时,用胰蛋白酶消化细胞,按1 ∶4传代培养。

1.2.2 氟化物处理LS8细胞 将LS8细胞接种到6孔板中孵育24 h,后加入含有浓度为2 mmol/L NaF的培养液,37 ℃,5% CO2分别培养0,12,24,48 h,收集细胞用于检测IL-1β,IL-6,TNF-α及NF-κB mRNA水平。

将LS8细胞接种到6孔板中孵育24 h,后加入含有2.0 mmol/L NaF的培养液,37 ℃,5% CO2分别培养0,8,15,30,60,120 min,收集细胞用于检测P38蛋白磷酸化水平。

1.2.3 qRT-PCR检测细胞mRNA改变 Trizol试剂提取细胞总RNA,酶标仪测定OD260/280并检测RNA浓度和纯度。根据RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒操作说明,对2 μg总RNA进行反转录合成cDNA。使用实时定量PCR仪进行实时荧光定量PCR,PCR反应体系:5 μl SYBR Green PCR反应液、0.4 μl cDNA模板、1 μl PCR引物,加双蒸水至10 μl。反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环。β-actin为内参对照,采用2-ΔΔCt法对样本进行相对定量。引物序列见表1。

1.2.4 Western blotting检测细胞P38蛋白磷酸化水平改变 收集细胞,加入70 μl RIPA裂解液冰上裂解30 min,4 ℃下离心5 min,收集上清。BCA法检测蛋白浓度,取细胞总蛋白15 μg,上样量10 μl,5 μl Marker,进行10% SDS-PAGE电泳。在200 mA恒流条件下,转膜1 h至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭PVDF膜2 h。后分别加入抗兔p-P38抗体(1 ∶1 000)、抗兔P38抗体(1 ∶1 000)、抗兔β-actin抗体(1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次后用山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1 ∶1 000)室温孵育1.5 h。用TBST洗膜3次后,将PVDF膜置于凝胶成像分析系统实验盒中,ECL发光液均匀放置于PVDF膜上,调整参数曝光后图像分析仪处理。

2 结果

2.1 过量氟对LS8细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达影响

2 mmol/L NaF分别干预LS8细胞12,24,48 h后,qRT-PCR结果显示:IL-1β、TNF-α mRNA表达均呈时间依赖性增加,24 h和48 h时与0 h比较差异有统计学意义(P<0.05,见图1);IL-6 mRNA表达在48 h时也显著增加(P<0.05,见图1)。

与0 h比较,*P<0.05图1 过量氟对LS8细胞IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA的表达影响Figure 1 Effect of high fluoride on IL-1β,IL-6 and TNF-α mRNA levels in LS8 cells

2.2 过量氟对LS8细胞NF-κB mRNA表达影响

2 mmol/L NaF干预LS8细胞12,24 h,qRT-PCR结果显示:NF-κB mRNA表达均显著增加(P<0.05,见图2)。

与0 h比较,*P<0.05图2 过量氟对LS8细胞NF-κB mRNA的表达影响Figure 2 Effect of high fluoride on NF-κB mRNA levels in LS8 cells

2.3 过量氟对LS8细胞P38磷酸化影响

2 mmol/L NaF短时间(0-120 min)作用LS8细胞时,Western blotting结果显示:P38磷酸化呈时间依赖性增加,即8 min和15 min时轻微增加,30 min时显著增加,最大量的磷酸化在120 min时发生(P<0.05,见图3)。

3 讨论

氟牙症发生主要有两方面原因。一方面,由于地理环境中氟丰度过高,引起地区性氟牙症流行,我国各省、市、自治区均有不同程度流行,以山东、陕西等省区病情较重;另一方面,人为摄入过量氟化物。当前饮水氟化、食盐氟化等全身用氟防龋措施在全球多个国家被广泛实施,含氟牙膏、含氟漱口水等局部用氟产品也已大量市场化,然而氟化物摄入又缺乏严格有效的指导和监督,从而导致氟牙症发病率增加,呈散发态势。然而,氟牙症目前无理想治疗方法。因此,深入探究氟牙症发病机制,对解决我国重要的公共卫生与临床治疗问题具有重要意义。近年来,学者们针对成釉细胞的氟毒性作用进行了大量研究,发现过量氟可从多个环节对成釉细胞造成损伤进而影响釉质矿化,然而对炎症的影响尚未见报道。因此,本研究着重观察过量氟对体外培养LS8细胞炎症因子的表达影响。

与0 min比较,*P<0.05图3 过量氟作用LS8细胞不同时间P38磷酸化情况Figure 3 Effect of high fluoride on the phosphorylation of P38 in LS8 cells

IL-1β、TNF-α和IL-6都是典型的前炎性细胞因子,可与特定受体结合进而诱导细胞内信号级联反应,在炎症发生发展中起重要作用[13,14]。汤婷婷等[15]报道NaF可刺激小胶质细胞活化,并释放TNF-α和IL-1β,而TNF-α和IL-1β的过量增多破坏血脑屏障,导致中枢神经系统损伤,然而在氟牙症发生中,过量氟对成釉细胞炎症因子的表达影响尚未见报道,本研究显示过量氟可使LS8细胞中IL-1、TNF-α和IL-6表达均显著增加,我们推测炎症反应很可能参与了过量氟导致的LS8细胞损伤过程。

NF-κB信号通路在炎症反应中起核心调控作用,可被应激、前炎症因子等激活。研究发现IL-1β、TNF-α等可激活NF-κB,而活化的NF-κB进一步引起TNF-α、IL-6、IL-1β等的大量释放,形成正反馈,进而引发持久的炎症反应,严重时导致细胞死亡[15,16]。本研究中,过量氟作用于LS8细胞12,24 h后,结果显示过量氟可增加NF-κB mRNA表达,提示NF-κB信号通路很可能参与了过量氟介导的LS8细胞炎性反应过程。

p38信号通路属于MAPK家族成员之一,被认为是与炎症反应关系密切的通路。磷酸化的P38可介导成骨细胞IL-1、TNF-α、IL-6等因子的产生,还可引起中性粒细胞活化[17]。本研究结果显示过量氟可呈时间依赖性增加LS8细胞P38磷酸化表达,提示p38信号通路很可能参与了过量氟介导的LS8细胞炎性反应过程。

综上所述,本实验观察了过量氟对LS8细胞炎性因子的表达影响,发现过量氟可增加IL-1β、TNF-α、IL-6、NF-κB mRNA以及p38蛋白磷酸化表达,提示过量氟可导致LS8细胞炎症反应的发生,NF-κB及p38信号通路很可能参与其中。然而,NF-κB及p38信号通路在过量氟诱发LS8细胞炎症反应过程中的作用机制,尚需深入探究。