柴胡桂枝汤通过sirt1-p53信号通路产生抗抑郁作用

葛鑫宇，郭 芳，范 俊，陈宝田，于 林，任 静，李纪强，卢成林，莫嘉文，李树基，袁乐欣，胡号应，刘 赟，周 晓，崔 娟，朱志敏，曹 雄

1广州医科大学附属脑科医院中医科，广东 广州510515；2精神健康研究教育部重点实验室//粤港澳大湾区脑科学和类脑研究中心//广东省重大精神疾病重点实验室//南方医科大学基础医学院神经生物学教研室，广东广州510515；3南方医科大学南方医院中医科，广东 广州510515；4南方医科大学珠江医院放疗科，广东 广州510282

抑郁症是一种常见精神疾病，全世界现有超过2.6亿人受到抑郁症的困扰，已成为一个严重的公共健康问题［1］。单胺假说是现在抑郁症的主要学说，据此开发的药物在改善抑郁症状方面取得了较好的疗效，但这些抗抑郁药物起效慢，有效率低，并伴有严重的副作用。因此，寻找和研发抗抑郁新药是当今抑郁症研究的重大科学问题之一［2］。

神经元突触可塑性是抑郁症发生及抗抑郁效应的重要的机制之一。现有研究提示突触可塑性与抑郁症病理机制密切相关［3-6］。此外，临床抗抑郁药可增强成年海马突触可塑性及神经发生［7-9］。已发表研究表明，沉默调节蛋白1（sirt1）-p53信号通路在抑郁发生和突触可塑性中扮演着重要的角色。遗传学研究发现中国女性重度抑郁症患者SIRT1基因位点突变［10］。在大脑中，上调神经元sirt1的表达可促进神经元突触可塑性相关基因表达［11-12］；p53是sirt1的重要下游信号通路，在神经元凋亡、萎缩、损伤中发挥重要作用［13］。

中医已被世界卫生组织纳入《第11版国际疾病分类规则》，并作为治疗指导意见［14］。中医药可能是抗抑郁药物研发的宝库。柴胡桂枝汤最早记载于《伤寒论》，现用于抑郁症临床治疗。我们前期已发表工作表明柴胡桂枝汤在临床抑郁症治疗中有显著的抗抑郁作用，但其机制不清楚［15-16］。柴胡桂枝汤在改善抑郁症患者症状有较为明显的作用，在啮齿类动物研究中，已有文章报道柴胡桂枝汤在强迫游泳实验和悬尾实验中，可减少小鼠的不动时间；但该文章未使用经典抑郁模型证明柴胡桂枝汤的抗抑郁效果；且未对其可能的作用机制进行深入研究和探讨。在本研究中，我们使用多种动物行为学实验评估柴胡桂枝汤的抗抑郁样作用；并探讨了柴胡桂枝汤通过sirt1-p53调节突触可塑性发挥抗抑郁样效应的机制。

1 材料和方法

1.1 药物

柴胡桂枝汤记载于《伤寒论》，处方药材组成具体为：柴胡、黄芩、半夏、党参、生姜、大枣、甘草、桂枝、白芍、龙骨、牡蛎、酸枣仁、合欢皮、远志、夜交藤。实验中使用各药材粉末状冲剂，是华润三九医药股份有限公司生产的标准化柴胡桂枝汤中药配方颗粒，混合冲泡后，储存于4 ℃冰箱，供后续实验使用。

1.2 动物

实验使用动物为成年雄性C57BL/6J小鼠（8～10周，20～25 g），采购于南方医科大学实验动物中心，以每笼3～4只的密度饲养于24±1 ℃、湿度为50%～70%的通气排风笼具系统（EVC）。小鼠安置于标准实验室条件，采用12 h光暗循环（早上8点到晚上8点开灯），并提供充足的食物和水。所有实验方案经南方医科大学动物伦理委员会批准，在《实验动物管理条例》指导下进行。

实验小鼠分为柴胡桂枝汤给药组及溶剂对照组：柴胡桂枝汤组（CGD）小鼠接受柴胡桂枝汤灌胃给药，药物浓度为17 g·kg-1·d-1；溶剂对照组（Vehicle）小鼠接受药物溶剂灌胃给药。在慢性社会挫败应激模型（CSDS）和社会交互实验（SI）实验中，造模和对照小鼠分别接受柴胡桂枝汤或溶剂灌胃7 d，具体分组为：CSDS+柴胡桂枝汤组（CSDS+CGD，17 g·kg-1·d-1）、CSDS+溶剂组（CSDS+vehicle）、Con+柴胡桂枝汤组（Con+CGD，17 g·kg-1·d-1）、Con+溶剂组（Con+vehicle）。

小鼠均首先进行7 d的灌胃给药，给药后再依次进行抑郁模型造模及行为学检测。

1.3 行为学实验

1.3.1 强迫游泳实验 强迫游泳实验采用圆柱形透明玻璃缸（高45 cm，直径19 cm），玻璃缸中装入清水，水深23cm，水温22～25℃。整个实验过程持续6min。实验时，首先将小鼠放入玻璃缸中，并使用EthovisionXT（Noldus,USA）软件记录、分析小鼠在后4 min内的不动时间。

1.3.2 旷场实验 旷场实验采用Versmax记录、分析系统，旷场规格为40×40×30 cm。将小鼠放置在旷场中央，使用Versmax系统记录小鼠自由运动探索5 min的运动距离和站立次数。

1.3.3 高架十字迷宫实验 高架十字迷宫实验由两个相对的开放臂（30×5×0.5 cm）和封闭臂（30×5×15 cm）组成，通过一个中央平台（5×5 cm）连接，呈十字状，离地面80 cm。小鼠在实验房间中适应30 min后，进行高架十字迷宫试验。将小鼠放置于中央平台，使用Ethovision XT（Noldus,USA）软件记录分析小鼠5 min内在开放臂和封闭臂上的停留时间。

1.3.4 新环境压抑进食实验 新环境压抑进食实验采用40×40×30 cm的方形旷场。在旷场中心放置糖丸，实验开始时，将小鼠放入其中一角，使用Ethovision XT（Noldus,USA）系统记录5 min内小鼠在新环境中首次抱起糖丸进食的时间（潜伏期）。实验结束后，将小鼠放回原笼中，记录5 min内的进食量，检测小鼠食欲。

1.3.5 慢性社会挫败应激模型 根据Berton等《Nature Protocols》及我们已发表工作中慢性社会挫败应激模型的实验步骤［17-18］，现简述如下：实验中使用的雄性CD1退役种鼠购自北京查尔斯河实验室，单笼饲养，使其产生领地意识，具有强烈的攻击行为。造模开始时将雄性C57BL/6J小鼠（8 w）放入CD1鼠笼中，CD1鼠猛烈攻击C57BL/6J鼠；10 min后实验人员终止实验；使用透明带气孔隔板分隔CD1鼠和C57BL/6J鼠，两鼠在该鼠笼中相处24 h。在此期间C57BL/6J小鼠可看到和嗅到CD1鼠，并受到CD1鼠骚扰，从而进一步产生心理应激。24 h后，将C57BL/6J鼠放入另一CD1鼠笼中，攻击10 min，又共处24 h。这个实验过程重复10 d。对照组小鼠每隔24 h更换与其配对饲养的小鼠，使其与不同的小鼠配对饲养。造模结果使用社会交互实验进行检测。

1.3.6 社会交互实验 在慢性社会挫败应激模型造模24 h后，使用社会交互实验检测C57BL/6J鼠抑郁样状态［18］。本实验检测盒制作材料为无味白色有机玻璃板，大小为：40 cm×40 cm×30 cm,在检测盒一边设置交互区，大小为24 cm×14 cm；交互区内放置一个透明带气孔有机玻璃方盒，用于放置CD1鼠。本试验进行两次检测，第1 次实验交互区不放入CD1 鼠，使用Ethovision XT（Noldus,USA）软件记录2.5 min内小鼠在交互区停留的时间。第2次检测，在交互区的透明带气孔有机玻璃方盒中放入CD1鼠，再次记录C57BL/6J鼠在2.5 min内在交互区停留的时间。

1.4 实时定量聚合酶链反应

本实验取小鼠海马组织，参照RNA提取说明书，使用TRIzol（TaKaRa）提 取 海 马 组 织 的RNA，使 用PrimeScriptTMⅡ1链cDNA合成试剂盒（TaKaRa）将提取获得的RNA 逆转录为cDNA；使用SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa）进行实时定量PCR。PCR循环参数：94 ℃预变性（2 min）、94 ℃变性（30 s）、60 ℃退火（30 s）、72 ℃延伸（30 s），重复40个循环。获取分析CT值，计算样本2-△△CT，相照内参标准进行比较。本实验检测突触可塑性相关蛋白synapsin I，Rab，SNAP25，Tubb的mRNA水平，本研究使用的引物如表1。

表1 用于qRT-PCR的引物序列Tab.1 Sequence of primers used in quantitative real-time PCR

1.5 蛋白质免疫印迹实验

本实验使用RIPA提取大脑海马组织蛋白，并使用BCA 试剂盒（Pierce）测定蛋白浓度；使用10% SDSPAGE 胶电泳分离等量蛋白样品，然后将蛋白转入PVDF膜（Millipore）；使用5%脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4 ℃孵育过夜；然后孵育1 h 二抗；化学发光试剂盒（Pierce）检测印迹。具体抗体：sirt1（1∶1000，Abclone 8469），P53(1∶1000，Abcam ab26），Acetylation-p53（1∶1000，Abcam ab183544），GAPDH（1∶1000，锐抗生物RM2002），Goat-anti mouse（1∶5000，锐 抗 生 物RM3001），Goat-anti rabbit（1∶2000，锐抗生物RM3002）。

1.6 统计分析

数值资料均以均数±标准差表示，采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析或双因素方差分析（ANOVA）比较各组间的统计差异，采用Bonferroni或Fisher LSD对各组间的多重比较检验，或采用非配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学检测柴胡桂枝汤对小鼠抑郁样行为、焦虑样行为和运动能力的作用

使用成年雄性C57BL/6J鼠，连续7 d灌胃柴胡桂枝汤或药物溶剂，并进行相关行为学检测（图1A）。在强迫游泳实验中，柴胡桂枝汤组小鼠的不动时间显著减少（两样本非配对t检验，P＜0.05，n=12/14，图1B）。在高架十字迷宫实验中，柴胡桂枝汤组与对照组小鼠在开放臂的时间无统计学差异[F（1,48）=0.0962，P=0.758，n=12/14]（图1C）。在新环境压抑进食检测中，柴胡桂枝汤组与对照组小鼠食用糖丸潜伏期（两样本非配对t检验，P=0.797,n=8/9）和食欲（非配对t检验，P=0.842，n=8/9）均无明显差异（图1D）。在旷场实验中，柴胡桂枝汤组与对照组没有显著性差异[非配对t检验，P=0.560（总运动距离），P=0.953（站立次数），n=12/14]（图1E）。

2.2 柴胡桂枝汤降低小鼠在慢性社会失败应激模型中的抑郁敏感性

图1 柴胡桂枝汤对小鼠抑郁样行为、焦虑样行为和运动能力的作用Fig.1 CGD produces antidepressant effect in mice in FST. A: Schematic representation of the behavioral tests. B: Immobility time of the C57BL/6J mice treated with CGD (n=12) or vehicle (n=14) in FST (P＜0.05). C: Time spent in the open and closed arms of CGD(n=12)and vehicle(n=12)groups in the EPM.F(1,48)=0.09622,P=0.758.D:Latency(P=0.797)to feed(P=0.842)and food consumption in the NSF test in CGD group(n=8)and vehicle group(n=9).E:Open field test in CGD(n=12)and vehicle(n=12)groups.P=0.560(total distance),P=0.9529(No.of standing).Data are presented as Mean±SE.*P＜0.05.

采用经典抑郁模型——慢性社会失败应激模型进一步明确柴胡桂枝汤在抑郁模型中的作用（图2A）。成年雄性C57BL/6J鼠经过连续7 d柴胡桂枝汤或药物溶剂灌胃，再经过10 d CSDS造模后进行社会交互实验的检测，实验结果发现CSDS+vehicle组小鼠在交互区停留的时间显著减少；而CSDS+CGD组在交互区停留的时间无明显降低，[药物×CSDS 交互作用F（1, 29）=7.475，P=0.011]（图2B）。然而，当交互区无CD1鼠时，CSDS+CGD组和CSDS+vehicle组小鼠在交互区的停留时间均无明显差异[药物×CSDS 交互作用F（1,29）=0.5982，P=0.4455]（图2C）。柴胡桂枝汤处理对动物体质量无明显改变[非配对t检验，P=0.370（给药前体质量），P=0.972（给药后体质量），n=16]（图2D）。

2.3 柴胡桂枝汤调控sirt1-p53信号通路及突触可塑性基因的表达

与溶剂对照组相比，柴胡桂枝汤组sirt1蛋白表达水平显著增加（非配对t检验，P＜0.05，每组n=6）（图3A、B）；sirt1下游蛋白p53的总体水平没有变化，但p53乙酰化水平明显下降[非配对t检验，P=0.931（总P53）、P＜0.05（乙酰化P53），每组n=4]（图3C、D）。

与溶剂对照组相比，柴胡桂枝汤组海马组织中的突触可塑性基因Syn1 mRNA水平显著升高（非配对t检验，P＜0.01，n=7/8）（图4A）；而Rab4B、SNAP25和Tubulin beta4b没有显著性差异[非配对t检验，P=0.813（Rab），P=0.820（SNAP），P=0.864（Tubb），n=6～8]（图4B～D）。

3 讨论

目前临床常用的抗抑郁药主要是基于单胺假说开发的药物，已取得了较好的治疗效果。但现有药物也具有起效慢、有效率低、副作用大和复发率高等不足。因此，有必要探索新的抑郁发生机制及抗抑郁新方法。中医学和中药已被纳入最新版（第11版）《国际疾病分类》［14］，是抑郁症治疗的有益补充。我们研究发现柴胡桂枝汤通过海马sirt1-p53信号通路调节神经元突触可塑性产生抗抑郁样作用，为柴胡桂枝汤作为抗抑郁药的临床使用提供了理论依据。

我们已发表临床研究表明，柴胡桂枝汤可改善抑郁症患者的症状，具有显著的抗抑郁作用［19］，但其抗抑郁机制仍不清楚。在啮齿类动物研究中，已有文章报道柴胡桂枝汤在强迫游泳实验和悬尾实验中，可减少小鼠的不动时间；但该文章未使用经典抑郁模型证明柴胡桂枝汤的抗抑郁效果；且未对其可能的作用机制进行深入研究和探讨［20］。我们研究发现柴胡桂枝汤灌胃7 d后（17 g·kg-1·d-1），小鼠在强迫游泳实验的不动时间显著缩短，具有抗抑郁效应。我们进一步使用了慢性社会失败应激模型验证柴胡桂枝汤的作用，结果发现柴胡桂枝汤可显著增加动物在社会交互区的停留时间，逆转慢性社会失败应激模型引起的抑郁样表型。以上多种动物行为学结果证明了柴胡桂枝汤在动物模型中的抗抑郁作用。

图2 柴胡桂枝汤降低小鼠在慢性社会失败应激模型中的抑郁敏感性Fig.2 CGD attenuates susceptibility of mice to chronic social stress. A: Schematic of the CSDS model and social interaction test. B, C: Time in the interaction zone of the CGD and vehicle-treated mice in the conditions of CD1 target and no target.Two-way ANOVA.(In B,medicine×CD1 interaction F(1,29)=7.475,P=0.011); n=8 for CSDS+CGD, n=11 for CSDS+Vehicle, n=8 for Con+CGD, and n=6 for Con+Vehicle. In C,medicine×CD1 interaction F(1, 29)=0.5982, P=0.4455) followed by Bonferroni post hoc test for multiple comparisons; **P＜0.01; ***P＜0.001. D: Body weight before and after intragastric administration. P=0.370(before),P=0.972(after)(n=16).Data are presented as Mean±SE.**P＜0.01;***P＜0.001.

图3 柴胡桂枝汤对小鼠海马脑区sirt1/p53-AC蛋白表达的作用Fig.3 CGD alters sirt1/p53-AC levels in the hippocampus of mice. A, B: Western blotting of sirt1 protein and quantitative results in CGD and vehicle-treated groups (n=6; P＜0.05). C-E: Western blotting of acetylated p53 (P＜0.05) and p53 (P=0.931)protein levels(n=4).Data are presented as Mean±SE.*P＜0.05.

sirt1是一种去乙酰化酶，具有高度保守、NAD+依赖性的特点，参与神经元树突分支形成和正常功能的维持［21-22］。SIRT1是首次发现的中国汉族女性抑郁症易感基因［10］。在sirt1神经元敲除鼠中，树突长度减少、分支复杂度降低，突触可塑性相关基因发生改变［23］。使用腺病毒上调神经元sirt1的表达可促进突触可塑性相关基因表达，并在行为学实验中产生抗抑郁样作用［24-25］。此外，已有研究报道sirt1调控p53、Nrf2、NLRP3、FOX1等胞内信号通路［26-27］。其中p53是sirt1的重要下游信号通路，活性形式为乙酰化p53蛋白；具有促进细胞衰老的作用，在神经元凋亡、萎缩、损伤中发挥重要作用［13］。在本研究中，我们使用蛋白质免疫印迹实验发现，C57BL/6J小鼠接受7 d柴胡桂枝汤灌胃给药后，其海马组织内sirt1蛋白表达水平上调；sirt1信号通路下游蛋白p53的乙酰化水平下调。这些结果提示柴胡桂枝汤具有上调sirt1表达的作用，其可能通过sirt1-p53信号通路参与抗抑郁样效应。

图4 柴胡桂枝汤对小鼠海马脑区Syn、Rab、SNAP、Tubb mRNA表达的作用Fig.4 CGD alters synaptic function-related genes in the hippocampus of CGD and vehicle-treatedgroups.A: Expression of Syn mRNA in CGD (n=7) and vehicle-treated (n=8) groups (P＜0.05). B-D: Expressions of Rab, SNAP and Tubb mRNA (P=0.813,0.820,and 0.864,respectively;n=6).**P＜0.01.

在海马、前额皮层等脑区，突触可塑性异常与抑郁发生密切相关［3］。突触蛋白-1（syn1）、RAB4B、突触小体相关蛋白（SNAP 25）和β-微管蛋白4b（Tubulin beta 4b）是突触可塑性的标志蛋白，参与突触可塑性［28-32］。在本研究中，柴胡桂枝汤灌胃后，海马组织syn1的mRNA水平显著升高，其他三种mRNA无显著性变化，提示柴胡桂枝汤可促进神经元突触Syn1的表达，调控突触可塑性，进而产生抗抑郁样效应。

综上所述，我们的研究结果证明柴胡桂枝汤在动物抑郁模型中具有抗抑郁样作用，其可能通过海马sirt1-p53信号通路调节神经元突触可塑性，进而产生抗抑郁样作用。我们的发现为柴胡桂枝汤作为抗抑郁药的使用提供了依据。然而，目前我们还不清楚柴胡桂枝汤中的哪些化合物产生的抗抑郁作用。我们将分离提取柴胡桂枝汤的活性成分，并使用多种抑郁模型测试其活性成分的抗抑郁作用。