Bex1和NF⁃kBp65在舌鳞状细胞癌组织中的表达及意义

王倩倩， 丁丹丹， 丁翔， 韩瑞， 韩影影， 周美云， 徐锦程

1. 蚌埠医学院第一附属医院口腔科，安徽 蚌埠（233004）； 2. 蚌埠医学院第二附属医院口腔科，安徽 蚌埠（233000）

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔鳞状细胞癌中最常见的类型，男性多于女性，但近年来有女性发病增多及发病年龄年轻化的趋势［1］。虽然TSCC 的诊断和治疗水平有所提高，但其预后仍较差，且局部浸润和远处转移是TSCC 患者预后较差的主要原因［2］。核因子⁃kB（nuclear factor kappa B，NF⁃kB）是真核细胞中一种重要的核转录因子，以p65/p50二聚体为中心的NF⁃kB 异常活化在肿瘤形成、侵袭和转移及抗凋亡机制中发挥重要作用［3⁃4］。脑表达的X 连锁基因1（brain expressed X⁃linked gene 1，Bex1）是Bex 家族的成员，近年来有研究发现Bex 参与细胞周期调控、细胞凋亡等重要的病理生理过程及一些癌症的发生发展过程。Lee 等［5］曾报道Bex1 在口腔鳞状细胞癌中表达下调，但Bex1 和NF⁃kB 与TSCC 临床病理特征和预后关系的研究较少。本文采用免疫组化法检测Bex1 和NF⁃kBp65 在TSCC 中的表达情况，并进一步探讨其与临床病理特征及预后的关系，以期为TSCC 的诊断和治疗提供有价值的参考。

1 资料和方法

1.1 基本资料

收集蚌埠医学院第一附属医院口腔科2012 年1 月至2014 年12 月经手术切除且病理证实为TSCC 的保持完整的石蜡组织标本60 例。所有患者术前均未行放、化疗，术后病理证实有淋巴结转移者转至放疗科放疗等。年龄36～82 岁，中位年龄62 岁，男性41 例，女性19 例。高分化者33 例，中分化15 例，低分化12 例。肿瘤直径＜2.0 cm 者21 例，2～4 cm 者25 例，＞4 cm 者14 例。根据美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）2010 年版对临床分期进行划分：Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期26 例。有淋巴结转移者19 例，其中淋巴结转移数目为1～3 枚者13 例，4 枚以上者6 例，无淋巴结转移者41 例。同时选择60 例癌旁正常上皮组织作为对照组。所有患者均进行电话随访，术后1 年内每3 个月随访1 次，术后第2 年每6个月随访1 次，从术后第3 年起每1 年随访1 次，共随访5 年。

1.2 主要试剂

兔抗人Bex1 和NF⁃kBp65 抗体、羊抗兔二抗均购自南京迈克沃德生物科技有限公司；DAB 显色剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 免疫组化

所有石蜡组织标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，4～5 μm 连续切片，脱蜡，高压抗原修复等，采用EliVision 法行免疫组织化学染色。一抗Bex1、NF⁃kBp65 稀释比例均为1∶300，一抗用PBS缓冲液代替作为阴性对照，TSCC 阳性切片作为阳性对照。

1.4 结果评判

免疫组化结果由2位高年资病理科医师在双盲下阅片并记录。每张切片随机选取5个独立高倍视野，计数100个肿瘤细胞。评分标准如下：①细胞着色强度，无着色或弱，0 分；淡黄色，1 分；棕黄色，2分；棕褐色：3 分；②染色阳性细胞百分数，＜5%，0分；5%～25%，1 分；26%～50%，2 分；＞50%，3分。总评分将两项得分结果相乘：＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.5 统计学分析

应用SPSS20.0 软件包对数据进行统计学分析，计数资料用率表示，组间比较用卡方检验，相关性分析采用Pearson 检验；单因素生存分析用Kaplan⁃Meier 生存曲线和Log rank 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Bex1 和NF⁃kBp65 蛋白在TSCC 和癌旁正常上皮组织中的表达

Bex1 和NF⁃kBp65 主要染色于细胞浆，后者部分细胞核中也可见阳性染色，所有蛋白的阳性表达均呈棕黄色或棕褐色（图1），Bex1 在TSCC 组织中低表达，NF⁃kBp65 在TSCC 组织中高表达。两者在TSCC 组织和癌旁组织中的阳性率差异具有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

Figure 1 Immunohistochemical examination of Bex1 and NF⁃kBp65 expression in TSCC and adjacent normal tongue tissues（×200）图1 Bex1 和NF⁃kBp65 在TSCC 和癌旁正常舌组织中表达的免疫组织化学检测（×200）

表1 TSCC 和癌旁正常组织中Bex1、NF⁃kBp65 的表达Table 1 The expression of Bex1 and NF⁃kBp65 in TSCC tissues and adjacent normal tissues n（%）

2.2 Bex1 和NF⁃kBp65 与TSCC 临床病理特征的关系

结果显示，Bex1 的阳性表达率与肿瘤直径、TNM 分期及淋巴结转移有关，差异有统计学意义（P＜0.05），而与性别、年龄、组织学分级均无关（P＞0.05）。NF⁃kBp65 的阳性表达率与TNM 分期、组织学分级和淋巴结转移有关，差异有统计学意义（P＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤直径均无关（P＞0.05），见表2。

2.3 Bex1 和NF⁃kBp65 在TSCC 中表达的相关性

根据相关性分析显示，Bex1 和NF⁃kBp65 在TSCC 中的表达呈负相关性（r＝⁃0.302，P＝0.019），见表3。

2.4 生存分析

Kaplan⁃Meier 生存分析显示NF⁃kBp65 阳性表达与TSCC 患者的生存率无关（P＝0.674）；Bex1 阳性表达的TSCC 患者平均生存时间为56 个月，而Bex1 阴性表达的TSCC 患者平均生存时间为42 个月，差异有统计学意义（P < 0.05）。结果表明，Bex1 阳性表达的TSCC 患者生存率明显高于阴性表达者（图2）。

3 讨 论

人脑表达X 连锁Bex 家族由Bex1、Bex2、Bex3、Bex4、Bex5 五个成员组成，位于染色体Xq22 区域，Bex1 和Bex2 在C 末端附近包含一个保守的基序Ser⁃Leu⁃Arg，该基序被蛋白激酶C 磷酸化，蛋白激酶C 由10 个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成，与许多癌症相关［6⁃8］。Bex 蛋白参与神经变性、癌症、细胞周期和肿瘤生长所涉及的转录调控和信号通路，并在一些恶性肿瘤中表达失调。Bex1 在肺腺癌中参与肿瘤的侵袭和转移并且与患者不良预后有关［9］；Bex1 在食管鳞状细胞癌中的低表达与食管鳞状细胞癌的临床预后不良相关，是影响总生存率的独立预后因素，体外实验结果显示Bex1 可能通过NF⁃kB 信号通路抑制食管癌的增殖和生长而发挥抑癌作用［10］；在颅内室管膜瘤中存在启动子高甲基化使Bex1 表达下调，而Bex1 过表达可抑制细胞的增殖［11］；Bex1 在伴有混合系白血病突变的急性髓系白血病中高表达，推测其可能起癌基因的作用［12］；Bex1 在一组FMS 样络氨酸激酶⁃3 驱动的急性白血病等疾病中表达下调等［13］。本研究结果显示，Bex1 主要染色于细胞浆，在TSCC 中的阳性表达率明显低于癌旁正常组织，且与肿瘤直径、TNM 分期、有无淋巴结转移有关，而与患者性别、年龄、组织学分级无关，Kaplan⁃Meier 生存分析显示Bex1 阳性表达患者的预后明显优于阴性表达患者，表明Bex1 可能参与了TSCC 的侵袭和转移，与TSCC 患者的不良预后有关。

表2 TSCC 中Bex1、NF⁃kBp65 的表达与临床病理特征的关系Table 2 Relationship between the expression of Bex1 and NF⁃kBp65 in TSCC and clinicopathologic features of patients with TSCC n（%）

表3 TSCC 中Bex1 和NF⁃kBp65 表达的相关性Table 3 Correlation of Bex1 and NF⁃kBp65 expression in TSCC

Figure 2 Kaplan⁃Meier survival curves of Bex1⁃positive and Bex1⁃negative TSCC patients图2 Bex1 阳性表达和阴性表达TSCC 患者Kaplan Meier 生存曲线

NF⁃kB 包括5 个多肽链亚基，其中p65 是NF⁃kB的主要功能蛋白，能发挥转录激活功能。以p65 亚基磷酸化为特征的NF⁃kB 活化在恶性肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移中发挥重要作用［3］。p65异常活化是NF⁃kB 通路激活的关键调控点，仍然是目前的研究热点。本研究结果显示，NF⁃kBp65 在TSCC 的表达明显高于癌旁组织，主要染色于细胞浆，部分细胞核中出现阳性染色，且随着TNM 分期增加，组织学分级越高、有淋巴结转移者NF⁃kBp65的表达越强，与蒋丽兰等［14］的研究结果一致。提示NF⁃kBp65 的异常活化在TSCC 的增殖、侵袭和转移过程中可能起重要的促进作用。根据文献报道，Bex 家族成员与NF⁃kB 通路之间有紧密联系，Bex1 的过表达对NF⁃kB 的活性有显著抑制作用［15］。本研究结果也表明Bex1、NF⁃kBp65 在TSCC组织中的表达呈负相关关系，提示NF⁃kB 信号通路可能参与了Bex1 促进TSCC 的增殖。

综上所述，本研究发现相较于癌旁组织，TSCC中Bex1 阳性表达率低，NF⁃kBp65 阳性表达率高，其表达水平与TSCC 的发展有关，提示两者可能与TSCC 的侵袭和转移有关。Kaplan⁃Meier 生存分析结果显示Bex1 阳性表达的平均生存时间长于阴性表达者，Bex1 的表达与患者的生存率有关，提示Bex1 对TSCC 的预后有一定的影响。本研究仅在组织学水平验证了Bex1 和NF⁃kBp65 在TSCC 中的表达和相关性分析，而Bex1 是如何通过NF⁃kB 信号通路促进TSCC的增殖的机理仍有待进一步研究。