五味子丙素体外抗胃癌细胞系AGS的活性

姚佳丽，徐海能，范齐昀，董昭骏，吴建章

温州医科大学 药学院 化学生物学研究中心，浙江 温州 325035

胃癌的发生与食用熏烤、盐腌食品等饮食习惯密切相关，因此其在我国等东亚人群中发病率极高，其中我国胃癌发病例数约占全球50%[1]。近年来由于胃镜等检测手段的普及，胃癌的早期诊断率在日本、韩国已分别高达60%、70%。而我国的早期胃癌诊断率仍然较低（＜10%），70%胃癌患者为进展期或晚期，化疗是进展期或晚期胃癌除外科手术以外的必备治疗手段[1-2]。但目前被批准用于胃癌临床治疗的靶向药物仅针对HER2和VEGFR靶点，氟尿嘧啶等传统细胞毒类化疗药物仍然是一线化疗用药，而该类药物具有非常大的不良反应[1，3]。

五味子丙素为木质素的一种，也是中药五味子中主要的活性成分之一，具有保肝[4]、抗氧化[5-6]、抗炎[7]等药理学活性。近年来相继发现木质素类化合物也具有较好的抗肿瘤活性，但是目前有关五味子丙素抗肿瘤活性的报道极少。本研究分析了五味子丙素的体外抗胃癌活性及其对临床化疗药物的体外增敏活性，为五味子丙素在临床中的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞AGS（上海生命科学研究院细胞资源中心），五味子丙素（成都普思生物科技有限公司），MTT粉末（上海碧云天生物技术有限公司），PBS缓冲液、青霉素-链霉素双抗、胎牛血清（美国Gibco公司），凋亡试剂盒（美国BD Biosciences Clontech公司），Cleaved-PARP抗体、Bax抗体（美国Cell Signaling Technology公司），Bcl-2抗体（美国Santa Cruz公司），GAPDH抗体（杭州贤至生物科技有限公司），结晶紫染色液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：AGS细胞培养于RPMI1640培养基置于恒温培养箱，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 MTT实验：将AGS细胞消化铺板，待细胞贴壁后，加药。药物孵育72 h后加入MTT溶液，4 h后吸去培养基，加入DMSO，在微型振荡仪上振荡至甲臜完全溶解后用酶标仪测定吸光值（OD值）。抑制率=（1-药物组吸光度的平均值/DMSO组吸光度的平均值）×100%。在测定药物对细胞生长抑制活性的半数抑制浓度（IC50）中，药物设置9个浓度（100、80、70、60、50、40、35、20、10 μmol/L），用Graphpad 7.0计算IC50。

1.2.3 细胞集落克隆形成实验：取AGS细胞铺入6孔板（5 000个细胞/孔）。培养20 h细胞贴壁后加五味子丙素，设置DMSO组、五味子丙素10 μmol/L组、五味子丙素20 μmol/L组、五味子丙素30 μmol/L组、五味子丙素40 μmol/L组。96 h后换液（同时再加五味子丙素）。7 d后，弃培养基，常规清洗后4%多聚甲醛固定。常规清洗后加结晶紫染色液。最后回收结晶紫染色液，常规清洗后晾干拍照。

1.2.4 流式细胞仪测定细胞凋亡：取AGS细胞铺于6 孔板（20 万个细胞/孔），20 h细胞贴壁后换液加五味子丙素。分别设置DMSO组、五味子丙素20 μmol/L组、五味子丙素40 μmol/L组、五味子丙素60 μmol/L组。药物孵育36 h后，收集全部细胞，PBS洗后，离心弃去PBS。加入稀释后的Annexin V binding buffer，在加Annexin V/PI共染。染色结束，流式细胞仪检测细胞凋亡率，FlowJo 7.6软件处理实验数据。

1.2.5 Western blot检测凋亡相关蛋白表达：取AGS细胞铺于6孔板，每孔20万个细胞。20 h细胞贴壁后加五味子丙素，药物分组同上。药物作用30 h后提总蛋白，制备蛋白样品。总蛋白常规电泳、转膜、封闭、抗体孵育（一抗1:1 000稀释，二抗1:5 000稀释）、常规洗膜，随后在凝胶成像系统下检测目的蛋白，并用Image Lab软件进行处理分析。

1.3 统计学处理方法 应用Graphpad Prism 7.0软件绘图，SPSS18.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五味子丙素抑制胃癌细胞生长 五味子丙素具有较好的体外抗胃癌活性，其IC50为（35.73±5.73）μmol/L（见图1）。集落形成实验显示，五味子丙素也能以浓度剂量依赖性地抑制AGS细胞生长，在浓度为20 μmol/L时对集落的形成就具有很好的抑制作用（见图2）。

图2 五味子丙素对AGS集落形成的影响

2.2 五味子丙素诱导AGS凋亡 流式细胞仪测定结果发现，五味子丙素在40 μmol/L时就能明显诱导胃癌细胞凋亡，并呈现出一定的浓度依赖性，其在浓度为40 μmol/L和60 μmol/L时细胞总凋亡率分别为32.1%和38.4%，晚期凋亡率分别为20.9%和22.8%，因此主要表现为晚期凋亡（见图3）。

2.3 五味子丙素对凋亡蛋白表达的影响 Western blot检测五味子丙素对凋亡相关蛋白表达的影响，结果发现50 μmol/L的五味子丙素孵育细胞24 h后就能够明显上调凋亡蛋白Cleaved-PARP，并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（见图4A）；不同浓度梯度的五味子丙素孵育细胞后，对Cleaved-PARP和Bcl-2的影响呈现出一定的浓度依赖性，在40 μmol/L下就表现出明显的活性（见图4B）。但是，五味子丙素对凋亡蛋白Bax的表达没有明显的影响。

图3 五味子丙素对AGS凋亡的影响

2.4 五味子丙素对5-FU的增敏活性 用MTT法进一步研究了五味子丙素对5-FU的增敏活性。结果显示设置的9 个联合用药浓度组合均具有比相应单药更强的抑制细胞生长活性（其中五味子丙素30 μmol/L+5-FU 2 μmol/L和五味子丙素40 μmol/L+5-FU 2 μmol/L联合组与5-FU 2 μmol/L单药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 3 μmol/L、五味子丙素40 μmol/L+5-FU 3 μmol/L联合组与5-FU 3 μmol/L单药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 4 μmol/L、五味子丙素40 μmol/L+5-FU 4 μmol/L联合组与5-FU 4 μmol/L单药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；五味子丙素20 μmol/L+5-FU 3 μmol/L和五味子丙素20 μmol/L+5-FU 4 μmol/L与五味子丙素20 μmol/L单药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 2 μmol/L、五味子丙素30 μmol/L+5-FU 3 μmol/L和五味子丙素30 μmol/L+5-FU 4 μmol/L与五味子丙素30 μmol/L单药组比较差异有统计学意义（P ＜0.05）；五味子丙素40 μmol/L+5-FU 4 μmol/L与五味子丙素40 μmol/L单药组比较差异有统计学意义（P＜0.05），可知五味子丙素表现了较好地增敏5-FU的抗胃癌活性。

3 讨论

图4 五味子丙素不同时间（A）和不同浓度（B）孵育对AGS凋亡相关蛋白表达的影响

图5 五味子丙素增敏5-FU的抗胃癌活性

五味子是一种在我国应用最广泛的滋补中药之一，在《神农本草经》中列五味子为上品，药用价值极高，能滋补强壮之力，有强身健体之效。五味子的主要活性成分为木质素，主要包括五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素[8]。研究显示，五味子的保护心脏和心血管、肝脏等作用与木质素类的抗炎、抗氧化活性密切相关[8]。近年来的研究显示，木质素类成分也具有良好的抗肿瘤活性，其中五味子乙素和五味子甲素都有较多的研究报道。如五味子乙素对肺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤均具有较好的体外抗肿瘤活性[9]；对胶质瘤、乳腺癌具有良好的体外和体内抗肿瘤活性[9]；五味子甲素对胆管癌[10]、结肠癌[11]、乳腺癌[12]、胰腺癌[13]均具有良好的体外肿瘤活性，对肺癌具有良好的体内外抗肿瘤活性[14]。而五味子丙素抗肿瘤活性的研究报道极少，目前仅PARK等[15]报道其通过抑制U937细胞的生长、阻滞周期和诱导凋亡来发挥抗肿瘤活性；LU等[16]报道其能较好地抑制肝癌细胞（Bel-7402）的生长[IC50=（81.58±1.06）μmol/L]。本研究发现五味子丙素能较好地抑制胃癌细胞生长，并能够明显影响凋亡相关蛋白（Cleaved-PARP、Bcl-2）的表达，诱导胃癌细胞凋亡。

靶向药物是抗肿瘤药物研发的热点，目前已有多种该类药物上市。但是，胃癌的靶向药物极少，应用于临床的仅有HER2抑制剂曲妥珠单抗和VEGFR抑制剂雷莫芦单抗，这导致了目前从靶向药物获益的胃癌患者极其有限[1]。因此胃癌化疗的一线主要用药仍然是氟尿嘧啶等经典细胞毒类化疗药物，而该类药物的选择性差，在靶向肿瘤的同时，对正常细胞核组织也具有很大的杀伤作用，不良反应非常大[1]。联合用药是解决此类问题的有效策略，最理性的联合药物应该是：能够对化疗药物增敏，且不增加不良反应，甚至可以降低化疗不良反应。但是，目前一般的联合用药策略均注重增敏，而安全性被忽略了，因此联合用药会带来更大的不良反应。从具有器官保护作用的药物中挖掘联合用药药物是最佳策略，如五味子乙素能使实验小鼠的心脏免受抗肿瘤药物多柔比星引起的不良反应，对铂类化合物引起的肾脏毒性具有缓解作用[9]。本研究发现五味子丙素具有很好地增敏5-FU的体外抗胃癌活性。由于五味子丙素对肝脏等器官也具有很好的保护作用，预期其对胃癌化疗增敏的同时，极大可能也会具有降低氟尿嘧啶类化疗毒性的作用，但其体内增敏和降低不良反应的药效还有待进一步深入研究。

综上所述，本研究发现五味子丙素不仅具有较好的体外抗胃癌活性，也具有明显增敏胃癌化疗的作用，可能成为低毒的胃癌化疗候选新药。