澳洲坚果果实结构的microCT无损测定分析*

李 兵 侯 晨 何波祥 梁东成连辉明 刘晚传 汪迎利 黄建雄

（1.广东省林业科技推广总站， 广东 广州 510173; 2.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院， 广东广州 510520; 3. 信宜市林业科学研究所，广东 信宜 525300）

澳洲坚果Macadamia spp. 是山龙眼科Proteaceae 澳洲坚果属Macadamia 植物，原产于澳大利亚昆士兰东南和新南威尔士东北部热带雨林地区[1]。澳洲坚果一般由粗壳种（M. tetraphylla L.A.S.Johnson）和光壳种（M. integriforia Maiden& Betche）或者两个物种的杂交种组成。澳洲坚果果仁含有较高的油份（72%以上），且有较高比例的油酸和棕榈酸；除较高的油脂含量外，澳洲坚果还含有较高比例的蛋白质和碳水化合物[2]，具丰富的营养和细腻口感，有“坚果之王”的美誉[1,3]。欧美国家对澳洲坚果的选育工作开展得较早，全世界选育澳洲坚果的国家有美国、澳大利亚、新西兰、南非和巴西等，选育出的澳洲坚果品种超过540 个、且形成较完善的产业格局[4]。

我国澳洲坚果选育工作起步较晚，开始商业性引种澳洲坚果仅从上个世纪七十年代开始[5]。前人对澳洲坚果引种、砧木嫁接和空中压条繁殖等方法做了较多的探索[3,6-7]。例如，何铣扬等[8]从开花、结果、产量和品质多个角度认为品种“849”比“842”更适合在广西龙州地区推广种植。陈显国等[9]对花穗长度、小花数量、小花座果率、小花成果率和产量等性状进行观察分析，对24 个澳洲坚果品种进行鉴定。种子选育方面，晏敏华等[10]对9 个不同品种澳洲坚果的11 个种子性状进行分类，划分为优秀、良好及一般3 种类型。杨为海等[11]亦对28 份澳洲坚果种质果实的16 个数量性状进行研究，将澳洲坚果种质划分为4 个不同性状表现的类群。

尽管前人对澳洲坚果种子形态和选育方面做了较多的工作，但由于澳洲坚果的种子由坚硬的外壳包裹，其内部结构难以清晰观测，因此人们对种子内部的结构特征不够清楚。1967 年Godfery N. Hounsifeld 首次利用多角度X 片收集被摄物体的三维信息，提出了计算机体层摄影术（computed tomography），且发明了世界上第一台CT仪[12]。近些年，随着医学技术的不断发展，CT影像的空间分辨率已从厘米数量级变为亚微米数量级，microCT 的空间分辨率已达到1～10 μm[13]。MicroCT 已在医学研究方面，如骨骼、牙齿和疾病机制研究有着广泛的应用[12]，但该技术在林木育种选育方面尚未开展类似的研究工作。本文通过microCT 技术开展了5 个广东省常见的澳洲坚果品种选育，旨在为我国澳洲坚果种子数字化选育提供有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 澳洲坚果材料收集

试验对象为广东省信宜市林业科学研究所种质资源圃内5 个品种：“900”、桂热一号（GR）、A16、“70”和“695”，选择5～6 年树龄、长势良好且无病害的植株，每个号收集3 个种子，共15个种子。

1.2 澳洲坚果基本特征测量

利用游标卡尺分别测量澳洲坚果5 个品种果实直径、果皮厚度、坚果直径和种壳厚度。

1.3 MicroCT 设置和参数

MicroCT 扫描检测在平生医疗科技（昆山）有限公司中完成。利用MicroCT（设备型号为VNC-102）对澳洲坚果多角度进行扫描。将澳洲坚果样本置于X 射线源和CCD 照相机之间，扫描过程中沿垂直长轴做180°旋转并保持在扫描区域内，根据不同品种澳洲坚果种子大小差异，进行200-400 次投射，由CCD 找摄像机捕获图像并传输到安装有图像处理软件的计算机中。整个扫描时间为3 400-5 000 ms。利用UG 和Mimics 软件逆向构建三维断面像，重建类型是迭代，重建尺寸为0.048×0.048×0.08 mm，维数1 024×1 024×560。

1.4 测量数据整理和聚类分析

利用Avatar 软件首先将数据转化为横向断层数据，每两个单位建立一层横向断层图像，间隔40 μm，然后重新构建澳洲坚果3D 图像。基于3D图像分别测量5 个澳洲坚果品种种子体积、种壳体积、种仁体积和种壳内的空隙率，即空隙体积/整个种子体积。以上获得了澳洲坚果基本特征和micro CT 分析参数各4 个，对每个参数值取log 10后做后续分析，然后对5 个品种8 个性状进行NJ聚类分析。此外，利用Excel 软件对澳洲坚果的基本特征和microCT 扫描后的果实特征进行T 检验，设置参数为单尾且满足双样本方差假设。

2 结果与分析

研究结果表明“900”果实直径和坚果直径皆最大，而“695”的果实直径和坚果直径最小（图1)。此外，A16 具有最厚的果皮和种壳，“695”的种壳最薄，“695”和GR 属于种皮皆较薄，但T检验结果表明两者无显著性差异（P= 0.062）。

通过microCT 扫描数据结果表明澳洲坚果果实的外形近似一个球体（图2a 和图2b)，但果实内部的种仁近似一个圆锥体（图2b 和图2c)。澳洲坚果果实除具有果皮、种壳和种仁外，在种壳内部还有空隙（图2c 和图2d)。

图2 利用microCT 技术扫描后图像重建澳洲坚果果实的形态Fig. 2 The morphology of a Macadamia spp. fruit was reconstructed using microCT scanning technique

从外皮结构来看，“900”和“695”的果皮比较粗糙，A16 次之，GR 和“70”的果皮比较光滑（图3）。“900”果实下端有锐尖的突起，A16、“70”和“695”果实下端有突起但较钝，而GR 的突起不明显。MicroCT 扫描5 个品种的澳洲坚果果实后发现“900”、GR、A16 和“70”都有较明显的外壳结构，而“695”的外壳不明显（图3）。此外，GR、A16 和“70”的种仁形状较扁，朝下一端有叫明显的突出尖头，而“900”和“695”的种仁形态较圆，朝下一端的突起较钝。

利用microCT 扫描技术测出“900”的果实最大，A16 和“70”次之，GR 和“695” 果实的体积最小（图4）。测得“900”的种子最大，GR 次之，A16 和“70”再次，“695”最小”。此外，“900”和A16 的种仁最大，GR 和“70”次之，“695”的种仁最小。此外，A16、“70”和“695”种子的空隙率较大，而“900”和GR 的孔隙率较小。

图3 MicroCT 扫描后不同品种澳洲坚果果实3D 多彩半透明展示Fig. 3 3D colorful translucent display of various Macadamia spp. varieties using microCT

最后，利用以上获得的澳洲坚果果实形态数据构建性状矩阵，然后利用log10 处理后进行聚类分析（图5）。结果发现“900”的性状特征与其它4 个澳洲坚果品种差异最大，其次差异较大的品种是“695”，剩下的3 个品种中GR 和“70”在形态上较相近，两者皆与A16 有较大差别。

3 结论与讨论

图4 MicroCT 扫描不同澳洲坚果品种果实与种子性状的比较Fig. 4 Comparison of fruit characters of Macadamia spp. varieties using microCT

图5 8 个澳洲坚果果实性状聚类分析结果Fig. 5 The results of cluster analysis based on eight characters of Macadamia spp.

我国澳洲坚果良种主要来源于国外引种和本土培育。本研究中“695”和A16 引种于澳大利亚，“900”和“70”引种于美国夏威夷[14]，而桂热一号是广西亚热带作物研究所通过引种“8”后选育出来的新品种[15]。聚类分析研究结果表明“900”、“695”和A16 的形态特征与桂热一号（GR）和“70”的种子差异较明显。该结果与贺熙勇等[14]的研究结果一致，后者研究表明“900”和“695”属于第I 亚类，即粗壳种与光壳种混种的后代。而A16 属于第II 亚类，虽然其亦为粗壳种与光壳种混种的后代，但更偏向于光壳种。桂热一号和“70”为光壳种，所以属于第III 亚类。

通过常规测量和MicroCT 扫描数据比较，我们发现“900”品种在5 个品种种子中脱颖而出，即具有体积最大的果实和种仁，种子内部空隙率最低。此外，由于桂热一号种子具有较薄的果皮和种壳、体积较大的种仁和较小的种内空隙率等特征，因此亦为较优质的澳洲品种。相比之下，A16 的种仁亦较大，但果皮和种壳较厚且种内空隙率较高，食用和工业加工方面受局限。“70”和“695”的种壳厚度均较薄且种内空隙率接近，但前者果实体积和种仁体积皆较大，因此“70”整体上优于“695”。

基于以上比较，我们认为5 个品种从优到劣的排序为“900”、桂热一号、A16、“70”和“695”。综上，本研究为首次应用microCT 技术对植物坚果进行扫描和形态构建，其诸多功能（如体积估计和空隙率计算）对澳洲坚果的选育和优劣鉴别起到重要的作用。