不同取样方法对小麦小孢子和花粉育性检测的影响

刘海英，甄俊琦，茹振钢，董 娜，冯必得

(1.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007； 2.河南科技学院小麦中心，河南新乡 453003)

小麦(TriticumaestivumL.)在世界各地广泛栽培[1-2]，是中国北方地区的主要食物来源[3]，河南是中国小麦的主产区[4]，提高河南小麦单产是中国粮食安全的重要保障[5]，杂种优势的广泛应用使农作物质量、产量、抗逆能力等方面均得到了显著提高[6-7]，因此提高小麦产量的首选方法是培育杂交小麦[8-9]。目前，国内在水稻[10]、玉米[11]、烟草[12]等领域的杂交制种研究已有报道，而对于小麦的杂交制种相关研究相对薄弱。在农作物杂交制种技术中应用较多的主要是两系法(光、温敏雄性不育)杂交制种[13-14]，小麦光温敏雄性不育系为两系法杂交制种提供了种质资源[15]。

“百农不育系”(Bai-Nong Sterility,BNS)由河南科技学院茹振钢教授育成[16]。BNS的花粉发育在抽穗前对环境温度十分敏感，当日平均气温低于8.9 ℃时，阻碍小孢子发育，花粉败育；当日平均气温高于8.9 ℃时，小孢子育性开始发生转化，花粉育性逐渐恢复，部分小花能够正常结实；当日平均气温高于14.4 ℃时，大部分花粉育性完全恢复，能够正常结实。温度是影响育性转换的主要因素，且受隐性核基因控制[17]，因此属温敏型核雄性不育。BNS366是用小麦温敏不育系BNS与郑麦366[18]杂交后经过饱和回交，在后代群体中选育成功的一个矮秆温敏雄性不育系，对BNS366进行基础研究是有效利用该品系的前提。

前人在花粉育性检测中，有些是采用的是全穗的花粉[19-20]，有些采用的是中部小穗的花粉[21]。不同取样方法检测到的花粉可育率是否存在显著差异，以及与自交结实率是否一致，目前尚未见报道。因此，本试验以郑麦366和BNS366为试验材料，设置早播和晚播两个播期，采用全穗取粉和中部取粉两种取样方法制片，观察I2-KI、醋酸洋红、DAPI三种染色方法的染色效果和花粉育性统计结果的差异，以期为明确小麦小孢子发育细胞学观察和花粉育性检测选取合适的取样方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

供试材料种植于河南师范大学小麦试验田，位于地处中原腹地的的新乡市，所属黄淮麦区(东经113°54′，北纬35°19′，海拔76.3 m)，属暖温带大陆性气候，四季分明，适合农作物生长。

1.2 试验材料

以温敏小麦雄性不育系BNS366及其近等基因系郑麦366为供试材料，均由河南科技学院小麦中心提供。于2017年10月11日(早播)和2017年12月2日(晚播)分两个批次进行播种，采用条播方式播种小麦，小区面积4.5 m2(1.5 m×3 m)，每个材料种植6行，行距20 cm，株距10 cm。单粒播种。按一般大田管理方式栽培，次年选代表型植株主茎穗进行研究。

1.3 试验设计

参照刘海英等[22-23]的农艺特征判断标准，在小孢子发育的开花期，于上午9:00-10:00，各选取10穗代表型植株主茎穗，每处理3次重复，置于FAA固定液(50%乙醇∶冰醋酸∶福尔马林=18∶1∶1)中，0.034×105Pa抽真空30 min后在4 ℃条件下固定24 h，移除FAA固定液，经90%-80%-70%-70%乙醇梯度置换固定液(每次置换时间均为30 min)，最后转入70%乙醇中保存备用。设置全穗取粉和中部取粉两种取样方法制片，然后进行后续染色观察。全穗取粉，是从麦穗上部、中部和下部小穗的第1位小花各取1枚花药，将3枚花药的花粉等量混合；中部取粉，是在麦穗中部沿穗轴一侧自下而上依次从3个小穗的第1位小花中各取1枚花药的花粉等量混合。

1.4 细胞学观察

参照刘海英等[22-23]的方法分别进行I2-KI法、醋酸洋红法和DAPI法染色和制片、在 Leica DMIL倒置荧光显微镜下(目镜10×，物镜20×)用白光观察I2-KI法、醋酸洋红法制好的片子，用紫外光观察DAPI法制好的片子，每张片子观察5个视野，并进行花粉育性统计。

1.5 套袋自交结实率调查统计

于抽穗后开花前各随机选取10个麦穗分别套袋，成熟期参照张思妮等[20]的方法调查和统计自交结实率。

结实率(国内法)=(有效小穗基部两侧小花结实数/有效小穗基部小花总数)×100%；

结实率(国际法)=(有效小穗结实数/有效小穗数×2)×100%。

1.6 数据分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0进行数据统计、处理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同取样方法所取花粉粒的染色结果

2.1.1 I2-KI法染色结果

由图1可知，早播和晚播郑麦366中部取粉和全穗取粉时，花粉粒绝大多数均呈饱满圆形，I2-KI法染色后，颜色均匀且为深色，表现为正常可育。

早播BNS366在两种取样方法下，花粉粒形状均不规则，且I2-KI染色结果为不正常深褐色，为典败型花粉；晚播BNS366在两种取样方法下，花粉粒形状均为圆形，少数花粉粒I2-KI染色不正常，为圆败型败育，其余花粉粒为I2-KI染色正常且为深色的正常可育型。不同取样方法下，BNS366和郑麦366的花粉粒染色结果差异 不大。

2.1.2 醋酸洋红法染色结果

由图2可知，早播郑麦366中部取粉时，花粉粒能看到细长拉伸呈鱼尾状精核，醋酸洋红法染色后，颜色为粉红色，绝大多数为正常可育花粉，花粉育性表现与全穗取粉时相比更加清晰；全穗取粉时，花粉粒绝大多数呈饱满圆形，醋酸洋红法染色后，颜色为紫红色，表现为正常可育。晚播郑麦366中部取粉时，花粉粒绝大多数为饱满圆形，醋酸洋红法染色后，颜色为暗紫色且分布均匀，达到正常可育状态；全穗取粉时，花粉粒花粉育性表现与中部取粉相似，能看到细长拉伸呈鱼尾状精核，醋酸洋红法染色后，颜色为紫红色，同样绝大多数为正常可育花粉。早播BNS366在两种取样方法下，花粉粒小孢子内均无内容物，为典败型花粉；晚播BNS366在两种取样方法下，花粉粒形状均为圆形，醋酸洋红染色后，颜色均偏紫红色，少数花粉粒为醋酸洋红染色不正常，为圆败型败育，其余花粉粒为醋酸洋红染色正常且能看到细长拉伸呈鱼尾状精核的正常可育型。不同取样方法下，醋酸洋红法染色后，郑麦366和BNS366的花粉粒形态差异不大，因烤片因素，颜色略有差异。

2.1.3 DAPI法染色结果

由图3可知，早播郑麦366在两种取样方法下，花粉粒绝大多数均呈饱满圆形，可观察到明显的发白发亮的细长拉伸呈鱼尾状精核，与醋酸洋红法染色结果相比，DAPI法染色后，清晰度更高，表现为正常可育；晚播郑麦366在两种取样方法下，花粉粒绝大多数为饱满圆形，可观察到明显的鱼尾状精核，除极个别不育外，绝大多数为正常可育。早播BNS366在两种取样方法下，花粉粒小孢子内均无内容物，为典败型花粉；晚播BNS366在两种取样方法下，花粉粒绝大多数为圆形，除个别花粉粒内无发光亮核外，其余花粉粒均为DAPI染色正常且能看到一个圆形营养核和两个梭型精核的正常可育型。不同取样方法下，DAPI法染色后，郑麦366和BNS366的花粉粒形态指示高度相似，对细胞核指示均清晰。以上结果说明，两种取样方法对细胞核发育状态观察无明显区别。

2.2 花粉育性与自交结实率比较

2.2.1 不同取样方法下I2-KI法染色后花粉可育率统计结果比较

由表1可知，I2-KI法染色后，两个播期的郑麦366和BNS366花粉可育率在不同取样方法下均无显著差异，除早播BNS366花粉可育率和自交结实率均为零外，早播和晚播郑麦366以及晚播BNS366国际法自交结实率与花粉可育率均无显著差异，国内法自交结实率极显著低于花粉可育率和国际法自交结实率。

2.2.2 不同取样方法下醋酸洋红法染色后花粉可育率统计结果比较

由表2可知，醋酸洋红法染色后，两个播期的郑麦366和BNS366花粉可育率在不同取样方法下均无显著差异；早播郑麦366花粉可育率与国内法自交结实率无显著差异，均显著或极显著低于国际法自交结实率；早播BNS366花粉可育率和自交结实率均为零；晚播郑麦366和BNS366国际法自交结实率与花粉可育率均无显著差异，国内法自交结实率极显著低于其花粉可育率。

表1 不同取样方法下I2-KI法染色后小麦花粉可育率与其自交结实率之间的差异Table 1 Differences of pollen fertility rates and self seedsetting rate collected with different sampling methods stained by I2-KI %

表2 不同取样方法下醋酸洋红法染色后小麦花粉可育率与其自交结实率之间的差异Table 2 Differences of pollen fertility rates and self seedsetting rate collected with different sampling methods stained by aceto carmine %

2.2.3 不同取样方法下DAPI法染色后花粉可育率统计结果比较

由表3可知，DAPI法染色后，两个播期的郑麦366和BNS366花粉可育率在不同取样方法下均无显著差异，除早播BNS366花粉可育率和自交结实率均为零外，早播和晚播郑麦366以及晚播BN366国际法自交结实率与花粉可育率均无显著差异，国内法自交结实率极显著低于花粉可育率和国际法自交结实率。

以上结果表明，不同取样位置下，三种染色处理对小麦花粉育性统计结果无实质性影响。醋酸洋红法染色后，早播郑麦366花粉可育率与国内法自交结实率无显著差异，均显著或极显著低于国际法自交结实率；另外，醋酸洋红法染色后，晚播BNS366国际法自交结实率与国内法自交结实率无显著差异；早播BNS366花粉可育率和自交结实率在三种染色方法后均为零，除了这三种情况之外，国际法自交结实率与花粉可育率均无显著差异，国内法自交结实率均显著或极显著低于花粉可育率和国际法自交结实率。

表3 不同取样方法下DAPI法染色后小麦花粉可育率与其自交结实率之间的差异Table 3 Differences of pollen fertility rates and self seedsetting rate collected with different sampling methods stained by DAPI %

3 讨 论

前人在开展BNS育性相关研究时，常涉及花粉可育率或败育率和自交结实率的检测，不同报道中具体方法存在差异。周美兰等[24]从全穗随机选取颖花，取其中花药进行花粉败育率检测。秦志英等[25]从主茎穗中部小花中取花药进行花粉可育率检测，采用国际法统计自交结实率。张保雷等[26]和马小飞等[27]采用国内法和国际法统计自交结实率，一般国际法自交结实率较高，但二者之间未进行差异分析。刘海英等[23]采用I2-KI法染色后检测花粉可育率，采用国内法统计自交结实率，发现前者数值偏高，差异达到极显著水平。选择来自全穗或来自小麦穗中部的花粉，在花粉可育率检测结果方面究竟是否存在差异，与国际法和国内法自交结实率之间吻合度如何，目前相关研究报道较少。

本研究结果显示，全穗取粉和中部取粉对小麦花粉粒形态及其细胞核发育状态基本一致；其花粉育性统计结果也无显著差异，除早播BNS366花粉可育率(全穗取粉和中部取粉)和自交结实率(国际法和国内法)均为零以外，其他播期材料花粉可育率一般与国际法自交结实率无显著差异，显著高于国内法自交结实率(除早播郑麦366小麦花粉醋酸洋红法染色后)。在进行花粉育性检测时，中部取粉可以节约固定、置换和保存样品所需试剂以及劳动量，并降低劳动复杂程度；全穗取粉花粉可育率和自交结实率数据均来自全穗，二者从试验材料角度分析吻合度更高；全穗取粉或中部取粉用于杂交小麦授粉时理论上差异不大，在实际工作中可根据需要自由选择。

国际法自交结实率(除早播BNS366)明显高于国内法自交结实率，从国际法、国内法自交结实率的计算公式中可以看出，使用国内法自交结实率计算时，统计的是每小穗基部两朵小花的结实数，而国际法自交结实率是将所有穗粒数全部统计在内，这可能是国际法的自交结实率偏高的主要原因。困惑之处在于，花粉育性检测用的花药均来自于小穗基部的1、2位小花，与国内法自交结实率的样品来源部位相同，但本试验结果显示，这两组数据并不一致，三种染色方法不同取样方法下花粉可育率均高于国内法，大多数与国际法自交结实率无显著差异，表明本试验所检测到的花粉可育率存在偏高现象，对此尚待进一步研究。

综上所述，中部取粉和全穗取粉对花粉育性检测结果无实质性影响，一般可以用来预测国际法自交结实率；中部取粉较为简便，全穗取粉科学严谨程度较高，在实际工作中可根据需要自由 选择。