不同大麦品种特异性SSR分子标记的筛选

曾 乐，杨天赐，姚佳延，洪 益，吕 超，郭宝健，许如根

(植物功能基因组学教育部重点实验室/江苏省作物基因组学与分子育种重点实验室/江苏粮食作物现代产业技术协同创新中心/扬州大学农业科技发展研究院，江苏扬州 225009)

随着育种速度的加快和作物种质资源鉴定与评价工作的深入，作物品种的类别和数量日渐增多，一批综合性状优良、配合力好的亲本在育种中被广泛应用，造成品种的遗传基础变窄以及近似品种数量增加，难以用形态学、生理生化等方法准确鉴定品种的真实性和纯度。随着分子生物学的发展，DNA指纹鉴定技术已广泛应用于农作物品种DUS鉴定[1]；简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)分子标记技术于1991年由Moore 等人创立，具有数量多、多态性高、重复性好、突变率低、标记共显性、引物具有通用性等优点[2-3]，被广泛应用于农作物品种真实性鉴定和纯度分析[4]。李晓辉等[5,12]利用SSR标记技术构建了我国主要玉米品种的DNA指纹图谱，用于鉴定玉米杂交种的真实性；张建华等[6]利用20对SSR引物构建了玉米黄早四的DNA标准指纹图谱；孟庆长等[7]从80对玉米SSR引物中筛选出4对引物用于准确鉴定苏玉20的纯度；苏顺宗等[8]筛选出多态性较高的SSR引物用于水稻品种的真实性鉴定和纯度鉴定；肖小余等[9]采用SSR标记构建了四川省26个杂交稻42个亲本的SSR指纹图谱；辛业芸等[10]和时宽玉等[11]应用SSR标记成功地构建了不同杂交水稻的分子指纹图谱；Almadanim等[13]仅用6对SSR引物就区分了51个葡萄牙酿酒葡萄品种。Upadhyay等[14]用3对SSR引物鉴别了21份印度的葡萄砧木材料品种。

大麦是世界上仅次于水稻、小麦、玉米作物的第四大作物，也是我国的主要禾本科植物之一[15]。作为非主要农作物，大麦品种通过登记即可推广。为保护育种者的知识产权，防止假冒伪劣种子对大麦市场的影响，开发快速、准确鉴别不同大麦品种的方法显得十分必要。Russell等[16]利用4对SSR引物区分了24个大麦品种，并鉴别了相同亲本的不同基因型大麦品种；Lin等[17]基于4对SSR引物，建立了17个大麦品种的等位基因检索系统，用于大麦品种的真实性鉴定；张志军等[18]利用筛选出的6对多态性丰富的SSR引物，可有效区分21个大麦品种；王艳平等[19]利用筛选出的28对多态SSR引物，对29个大麦DUS测试标准品种进行了遗传多样性分析和指纹图谱的构建。以上研究表明，SSR技术可有效用于大麦品种的真实性鉴定。但由于所用材料的不同，不同研究者所用的SSR引物数及组合存在差异。随着大麦品种检测数目和近似品种的增加，少量核心引物组合的鉴定能力降低，有必要对鉴定大麦品种所需的标记数量、组合做进一步研究，以提高鉴别不同大麦品种的能力。本研究利用SSR标记对3类不同来源组的大麦品种进行遗传多样性分析，研究鉴别不同来源组内不同品种所需的最少标记数和最佳标记数，为大麦标准品种指纹图谱库的更新及大麦品种真实性与纯度鉴定标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为来自于国内外的44个大麦品种(名称及来源见表1)，依据各材料来源差异，将其分为3个不同来源组：江浙沪组、国内组和国际组。江浙沪组主要包括江苏、浙江、上海3省市育成的沿海冬性啤酒大麦品种，品种相似性最高；国内组品种主要来自我国南方冬大麦区，品种的生态类型差异较大，品种的相似性相对较大；国际组品种有5个品种来自日本、美国及匈牙利；其余15个品种来自国内南方冬大麦区，其品种产地生态类型差异较大。3个组别的划分是递进的关系，组别间部分品种相同。

1.2 田间设计

将44个参试大麦品种种植于扬州大学作物遗传育种试验田和扬州大学七里甸农场试验田，每个试验田每个品种种植1行，行长1.2 m，行距0.2 m，每行点播20粒，株距0.06 m，重复3次。

1.3 试验方法

1.3.1 大麦DNA的提取

参照Murray等[24]的方法，于大麦2叶1心期，采用CTAB法提取叶片DNA。

1.3.2 SSR引物的筛选

从GrainGenes网站(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)及已发表文献[20-23]中查找大麦SSR标记，根据标记在染色体上的分布及位置，随机选取均匀分布于大麦7条染色体的28个多态性较好的SSR标记。28个标记中，3个GBM标记系列引物序列由德国IPK研究所提供，其余标记参照GrainGenes网站公布的序列。所有引物由华大基因公司合成，具体信息见表2。

表1 参试大麦品种的编号、名称及组别Table 1 Number,name and group of 44 barley varieties

1.3.3 PCR扩增体系和产物检测

PCR反应总体积为20 μL，其中10×PCR Buffer 2.0 μL，Mg2+2.0 μL、dNTPs 0.4 μL、ddH2O 10.4 μL、上下游引物3.0 μL、Taq酶0.2 μL，模版DNA 2.0 μL(50 ng·μL-1)。PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃(退火温度因引物而异，以55 ℃为例)45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。采用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。电泳结束后参照Karakousis等[25]的银染法进行显影，具体操作步骤为：ddH2O漂洗1次，硝酸银银染10 min，ddH2O再漂洗1次，氢氧化钠加甲醛显色直到带型清晰，ddH2O再次漂洗之后，拍照记录带型。

表2 28个SSR标记的名称、引物序列及染色体位置Table 2 Name,sequence and chromosome location of 28 SSR markers

1.3.4 SSR标记的数据记录与统计分析

用多变量分析系统NTSYS-pc 2.10e统计软件中的SM法计算遗传相似系数，用SHAN Clustering和非加权组平均法(un-weighted pair group method with arithmetic mean,UPGMA)对供试品种进行聚类分析。用软件SPSS 16.0中的LSD法进行方差分析和多重比较。为进一步确定不同来源组大麦品种最佳SSR标记组合，以品种间存在两个或两个以上的差异位点数为品种鉴别筛选条件[26]，用MATLAB软件[26]通过编程计算，确定鉴别区分3类不同来源组大麦品种分别需要最少的标记组合。

2 结果与分析

2.1 SSR分子标记在参试品种间的多态性分析

由表3可以看出，28个SSR标记在44个参试材料中共检测到102个差异等位基因，各标记的等位变异数介于2～6个，平均3.64个，其中，24个标记在44个参试材料中的等位变异基因数在3个以上。SSR标记的PIC值在0.08～0.77之间，平均为0.45。标记Bmag0914的PIC值最高，为0.77；标记EBmac0705的PIC值最低，为0.08。28个SSR标记中，有4个标记为低度多态性位点，占14.3%；有11个标记为高多态性位点，占39.3%；有13个标记为中度多态性位点，占46.4%，说明选用的28个SSR标记在参试品种间具有丰富的等位变异。28个SSR标记在参试大麦品种间的H值在0.18～1.68之间，平均为0.92。其中标记Bmag0914的H值最高，EBmac0705的H值最低，与PIC分析结果一致。进一步说明选用的SSR标记在参试大麦品种间具有较高的多态性。图1展示了标记HVM36在不同来源组大麦品种间的多态性。

表3 28个标记在参试品种间的多态性Table 3 Polymorphism of 28 markers among the tested varieties

2.2 基于SSR分子标记的参试品种遗传相似性分析

44个大麦品种间的遗传相似系数的变化范围在 0.529～0.961之间，均高于0.5，平均为 0.716，表明参试品种间遗传亲缘关系较为接近。由表4可知，江浙沪组、国内组及国际组的遗传相似系数均值分别为0.774 6、0.730 5和0.692 6，差异达极显著水平。

表4 不同来源组大麦品种间的遗传相似系数多重比较Table 4 Multiple comparisons of genetic similarity coefficients among different groups

2.3 鉴别筛选不同来源组大麦品种的SSR标记组合

利用MATLAB软件对28个SSR标记的指纹数据在不同来源组大麦品种中进行1 000次模拟试验，结果(图2)可以看出，若不对标记加以选择(随机使用这些标记)，鉴别江浙沪组、国内组和国际组大麦品种至少需要的标记数分别为27、20和23个。

若从中精挑细选，可以获得区分44个国内外大麦品种所需要的最少标记数，以品种间存在两个或两个以上的差异位点为筛选条件，江浙沪组、国内组和国际组的最少标记数分别为7、6和6个(表5中标**的标记)。考虑到分子标记在大麦染色体上分布的均匀性及其对同一来源组其他大麦品种鉴别的广适性，结合各分子标记多态性及不同分子标记组合的聚类效果，初步认为鉴别江浙沪组、国内组及国际组的最佳SSR标记数分别为14、15和15个(表5中标**和*的标记)。其中，江浙沪组14个最佳SSR标记共检测到57个等位基因，平均4.07个，其中标记Bmac0316的H值最低，为0.46，标记Bmag0914最高，为1.68；国内组15个最佳SSR标记共检测到49个等位基因，平均3.77个，其中标记Bmac0316的H值最低，为0.46，标记scssr03907的H值最高，为1.61；国际组15个最佳SSR标记共检测到52个等位基因，平均4.33个，其中标记Bmac 0316的H值最低，为0.46，标记Bmag 0914H值最高，为1.68。

表5 鉴别不同来源组大麦品种的标记数Table 5 Number of markers for identifying barley varieties from different groups

以鉴别不同来源组大麦品种所需的最佳SSR标记对相应来源组大麦品种进行聚类分析，结果(图3)可以看出，标记在江浙沪组、国内组和国际组大麦品种间的遗传相似系数分别在0.47～0.86、0.35～0.77、0.25～0.83之间。当遗传相似系数分别为0.57、0.45、0.40时，江浙沪组、国内组和国际组大麦品种分别可划分为4、4和5大类，来源地相同的品种大多被聚到相似的组内。遗传相似系数为0.86时，江浙沪组中浙秀12与花30被聚为一组；遗传相似系数为0.77时，国内组中川52209和驻7被聚为一组；遗传相似系数为0.83时，国际组中Frankin与T98189被聚为一组。尽管遗传相似系数很高，但结合各自分子标记信息，浙秀12和花30、川52209和驻7、 Frankin与T98189分别存在2、3和3个位点差异，按照规程应为不同的大麦品种[26]。说明所选标记及组合可以有效的鉴别不同来源组的大麦 品种。

3 讨 论

目前，基于形态标记的DUS测试仍然是鉴定品种真实性和纯度的主要手段，也是植物品种侵权案件判定的重要技术手段，在品种授权、市场准入和品种登记等方面起着不可替代的作用，是现代种植业健康发展的重要技术保障。与DUS形态鉴定法相比，SSR标记鉴定法具有多态性高、操作简单、测试周期短等优点，能从基因水平上比较全面反映不同品种间的遗传差异，作为一种辅助手段已广泛应用于大麦新品种的鉴定中。但现有标准品种的SSR指纹图谱在实际应用中仍然存在一定局限性，构建市场上推广品种及新审定品种的指纹图谱，完善及更新现有标准品种的指纹图谱库，才能更好地用于品种的鉴定[19]。本文选择近20年不同地区育成的大麦品种为材料，既考虑到参试大麦品种的来源地和生态类型，也考类到品种的育成年代和推广应用情况，具有较好的代表性。

本研究利用分布在大麦7条染色体上的28个SSR分子标记，在44个大麦品种中共检测到102个多态性位点，每个标记平均3.64个，各标记位点的PIC值在0.08～0.77之间，平均为 0.45。28个标记的Shannon’s多样性指数在44个品种间的值在0.18～1.68之间，平均为0.92。Shannon’s多样性指数是衡量种群多样性的指数，Shannon’s多样性指数越高，表明物种的多样性就越高。根据28个SSR标记的DNA指纹信息聚类结果，发现所选标记完全可以有效鉴别区分开3类不同来源组内的大麦品种。为筛选能鉴别不同来源组大麦品种的最少标记数和最适的标记组合，以及考虑到分子标记在大麦染色体上分布的均匀性及其对同一来源组其他大麦品种鉴别的广适性，并结合各分子标记多态性及不同分子标记组合的聚类效果，本研究初步认为，鉴别江浙沪组、国内组和国际组大麦品种所需要的最佳标记数分别为14、15和15个，说明15个SSR标记组合可有效地鉴别国内外44个不同来源的大麦品种。但上述结果尚需到大麦种子生产和市场管理中加以应用并验证。