丙泊酚激活PI3K/Akt/mTOR通路对脑缺血大鼠的神经保护作用

吴丽玉 赵立福 王茜 刘廷文

缺血性脑卒中是临床常见的脑血管疾病患者预后差，大多数会因脑损伤而引发偏瘫、行走障碍等后遗症[1,2]。丙泊酚作为一种静脉麻醉药，广泛用于外科手术麻醉，可使重症监护室患者镇静。危重病症及重大手术患者常伴有脑缺血并发症，而丙泊酚可通过抑制琥珀酸积累来减轻局灶性脑缺血再灌注导致的氧化应激反应[3]；并可改善神经功能缺损及认知功能障碍，促进大脑功能恢复，起到神经保护作用[4]，但其作用机制目前尚未清楚。研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路介导脑缺血再灌注后病理损伤过程，是保护缺血性脑损伤的作用靶点，激活该通路，可减轻新生儿脑缺氧缺血性脑损伤[5]，并修复卒中后大鼠神经功能，提供神经保护[6]，而丙泊酚可通过激活PI3K/Akt通路来抑制大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡，发挥肺保护作用[7]，因此推测丙泊酚可能通过激活PI3K/Akt/mTOR通路对脑缺血大鼠发挥神经保护作用，本文通过建立脑缺血大鼠模型，对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠购自由广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2016-0002，动物质量合格证号:44007200021086，SPF清洁级，雄性，体重(240±20)g。所有大鼠在本院动物房中饲养，保持环境清洁、安静、通风良好，温度保持约22℃～25℃，相对湿度保持约50%～60%，12 h/12 h间断照明，大鼠自由进食、饮水，定期更换垫料、添加饲料及饮用水。

1.2 主要试剂及仪器 丙泊酚注射液(国药准字：J20040122)，北京费森尤斯卡比医药有限公司；LY294002(HY-10108)，美国MCE公司；三苯基氯化四氮唑(2、3、5-Triphenyte-trazoliumchloride，TTC)(298964)，美国Amresco公司；大鼠中枢神经特异性蛋白(specific protein 100β，S100β)ELISA试剂盒(YS04063B)，上海雅吉生物科技有限公司；大鼠神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)ELISA试剂盒(SBJ-R0081)，南京森贝伽生物科技有限公司；大鼠IL-6 ELISA试剂盒(ab100772)、大鼠TNF-α ELISA试剂盒(ab100785)、兔源GAPDH一抗(ab181602)、兔源PI3K一抗(ab151549)、兔源p-PI3K一抗(ab138364)、兔源AKT一抗(ab179463)、兔源p-AKT一抗(ab38449)、兔源mTOR一抗(ab2732)、兔源p-mTOR一抗(ab84400)、羊抗兔二抗(ab150077)，美国Abcam公司；RIPA裂解液(P0013K)、BCA试剂盒(P0011)、HE染色试剂盒(C0105)，上海碧云天公司等。SMZ745光学显微镜(日本尼康公司)；EG1160包埋机、HI1220烤片机、CM3050S切片机(德国Leica公司)；XElx800酶标仪(美国Perkin Elmer公司)；1659001蛋白电泳仪、Trans-Blot Turbo转膜仪(美国Bio-Rad公司)；Centrifuge 5424R低温高速离心机(德国Eppendorf股份公司)；GIS-500凝胶成像仪(Miulab公司)等。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备及分组给药:①参考文献[8]中方法，以45 mg/kg剂量腹腔注射2.5%戊巴比妥钠麻醉大鼠，颈部备皮消毒，逐层切开皮肤，钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)，以动脉夹夹闭ICA并结扎CCA、ECA近心端，使用手术剪于颈外动脉近分叉处剪一“V”形切口，插入1根直径为0.24 mm拴线直到大脑中动脉起始处，然后逐层缝合，将拴线尾端暴露于皮肤外，缺血2 h后，抽出栓线，完成模型制备。采用Longa分级法对造模大鼠进行神经功能缺损评分[10]，当大鼠评分1～3分时，表示模型制备成功，共制备模型56只，成功48只，随机分为模型组、LY294002组、丙泊酚组、丙泊酚+LY294002组，每组12只。另取12只大鼠仅做CCA、ECA、ICA钝性分离后缝合伤口，设为假手术组。②参照文献[11]，丙泊酚经股静脉持续泵注，剂量为1 mg·kg-1·min-1，持续1 h，LY294002以0.3 mg/kg[12]的剂量尾静脉注射，假手术组与模型组大鼠，以等剂量0.9%氯化钠溶液尾静脉注射，持续3 d。

1.3.2 大鼠神经损伤检测及标本收集:①给药结束24 h后，参照表1的标准以Longa分级法对5组大鼠进行神经功能缺损评分，然后尾静脉取血2.5 ml，静置20 min后，3 000 r/min 4℃离心15 min，收集上清液即血清，储存在-80℃冰箱中备用。②神经功能缺损评分结束后，各组大鼠麻醉后处死，解剖取出脑组织。其中随机选6只脑梗死测定，其余6只剪取约0.5 g储存在-80℃冰箱中备用，剩余脑组织以0.9%氯化钠溶液漂洗、4%多聚甲醛固定、低浓度到高浓度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切片机做病理切片，选取完整的切片进行脱蜡、高浓度到低浓度梯度乙醇浸泡，然后HE试剂盒染色，具体步骤参照说明书，以0.9%氯化钠溶液漂洗后，再次脱水、透明后，以中性树胶封片，在光学显微镜下观察脑组织神经元病理变化，任意选取5个视野拍照。见表1。

表1 神经功能缺损评分

1.3.3 大鼠脑梗死体积检测:脑梗死测定脑组织沿冠状切面做切片，得到厚度大致相同的5片，加入2%TTC染液，37℃避光染色30 min，蒸馏水漂洗1次，4%多聚甲醛固定，4℃过夜，肉眼观察切片并拍照，使用Image pro软件分析图片计算大鼠脑梗死体积，公式为：脑梗死体积=全脑梗死体积/全脑片体积×100%。

1.4 大鼠血清S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平检测 前面所得血清置于4℃冰箱中解冻，大鼠ELISA试剂盒检测血清中S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平，具体步骤参照说明书进行。

1.5 大鼠脑组织PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达检测 将1.2中储存在-80℃脑组织剪碎，加入蛋白裂解液使用匀浆机制备为匀浆液，3 000 r/min 4℃离心20 min，提取总蛋白，采用BCA试剂盒，参照说明书的步骤测定其浓度，各组取相同体积的样品液电泳分离蛋白，并将其转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，根据蛋白分子量截取目的蛋白条带，置于小盒中做好标记，使用兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR一抗4℃下孵育过夜，然后使用羊抗兔二抗室温孵育2 h，采用增强化学发光法对蛋白条带显色后，以凝胶成像系统拍照，并使用Quantity One软件对条带分析。

2 结果

2.1 5组大鼠脑梗死体积 与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积显著升高(P<0.05)。与模型组比较，丙泊酚组大鼠脑梗死体积降低(P<0.05)；LY294002组大鼠脑梗死体积升高(P<0.05)。与LY294002组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠脑梗死面积降低(P<0.05)。与丙泊酚组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠脑梗死体积升高(P<0.05)。见图1，表2。

图1 TTC染色检测5组大鼠脑梗死体积；A 假手术组；B 模型组；C 丙泊酚组；D LY294002组；E 丙泊酚+LY294002组

表2 5组大鼠脑梗死体积

2.2 5组大鼠脑组织病理损伤变化 假手术组大鼠神经元结构完好，细胞核形态正常，胞浆淡染，呈淡蓝色，无损伤。与假手术组比较，模型组大鼠脑组织出现神经元凋亡、坏死，数目减少，细胞核固缩、变小、深染呈蓝色等病理损伤变化，神经功能缺损评分显著升高(P<0.05)。与模型组比较，丙泊酚组大鼠脑组织神经元病理损伤减轻，神经功能缺损评分降低(P<0.05)；LY294002组大鼠脑组织神经元病理损伤加重，神经功能缺损评分升高(P<0.05)。与LY294002组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠脑组织神经元病理损伤减轻，神经功能缺损评分降低(P<0.05)。与丙泊酚组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠脑组织神经元病理损伤加重，神经功能缺损评分升高(P<0.05)。见图2，表3。

2.3 5组大鼠血清S100β、NSE水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清中S100β、NSE水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，丙泊酚组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)；LY294002组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。与LY294002组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。与丙泊酚组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。见表4。

图2 5组大鼠脑组织(HE×400);A 假手术组；B 模型组；C 丙泊酚组；D LY294002组；E 丙泊酚+LY294002组

表3 5组大鼠神经功能缺损评分

表4 5组大鼠血清S100β、NSE水平

2.4 5组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，丙泊酚组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)；LY294002组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。与LY294002组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。与丙泊酚组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。见表5。

2.5 5组大鼠脑组织PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR显著降低(P<0.05)。

表5 5组大鼠血清IL-6、TNF-α水平

与模型组比较，丙泊酚组大鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.05)；LY294002组大鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05)。与LY294002组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.05)。与丙泊酚组比较，丙泊酚+LY294002组大鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05)。见图3，表6。

图3 5组大鼠脑组织中PI3K/Akt/mTOR通路蛋白免疫印迹检测结果

表6 5组大鼠脑组织PI3K/Akt/mTOR通路蛋白相对表达

3 讨论

缺血性脑损伤病理机制复杂，脑组织缺血部位不仅因缺血发生坏死，还可引发炎性反应，造成大量细胞凋亡，其中神经元大量死亡是神经功能丧失的主要原因，因此抑制炎性反应发生，是治疗缺血性脑损伤的关键环节[12]。本文以大脑中动脉线栓法建立脑缺血大鼠模型，结果显示，模型组大鼠脑组织出现神经元凋亡、坏死，数目减少，细胞核固缩、变小、深染呈蓝色等病理损伤变化，神经功能缺损评分、脑梗死体积显著升高，表明大鼠脑组织发生缺血性梗死，神经元细胞凋亡、数目减少，神经功能出现障碍。星形胶质细胞标志蛋白S100β及NSE水平是检测脑损伤的敏感指标，两者在神经组织中广泛分布，大脑出现损伤时能穿过受损的血脑屏障进入血液中，使血液中水平升高[13]；IL-6、TNF-α是机体免疫细胞合成的促炎性细胞因子，可促进脑缺血后脑组织炎症发生发展，加重脑损伤[14]，模型组大鼠血清S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平显著升高，表明脑缺血引起大鼠脑组织炎症的发生，破坏血脑屏障，导致脑损伤，揭示模型建立成功。

研究发现，丙泊酚可抑制炎性反应，保护大鼠肝脏免受缺血再灌注损伤影响[15]；通过抑制TLR/NF-κB信号传导，减轻缺血后脑组织炎症损伤，促进神经功能恢复，发挥神经保护作用[16]。丙泊酚的神经保护作用与其抗炎症作用相关。PI3K/AKT/mTOR信号介导氧化应激、炎性反应、细胞凋亡等多种生理过程，在脑缺血后神经炎性反应中起重要调节作用，激活该通路能够抑制神经炎症发生及进展，抑制神经元凋亡，促使脑功能恢复[17]；而在对心肌缺血/再灌注损伤研究中发现，丙泊酚可激活PI3K/Akt信号通路，发挥心肌保护作用[18]。但丙泊酚是否通过激活PI3K/Akt/mTOR通路对脑缺血大鼠发挥神经保护作用，目前尚不清楚，本文通过PI3K抑制剂LY294002处理脑缺血模型大鼠对此进行研究。结果显示，LY294002处理模型大鼠后，脑组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平降低，神经元病理损伤加重，神经功能缺损评分、脑梗死体积、血清S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平均升高；表明抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活，可升高脑组织梗死体积，增强缺血后脑组织炎性反应，加重神经功能损伤。丙泊酚及LY294002联合处理模型大鼠，其脑组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比LY294002组升高，但比丙泊酚组低；神经元病理损伤比LY294002组减轻，但比丙泊酚组损伤严重；神经功能缺损评分、脑梗死体积、血清S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平比LY294002组降低，但比丙泊酚组高。表明LY294002可抑制丙泊酚对PI3K/AKT/mTOR通路的激活作用，且阻止丙泊酚降低脑梗死体积、抑制炎性反应，减弱丙泊酚对神经功能障碍的修复及脑损伤的减轻作用，揭示丙泊酚对脑缺血大鼠发挥神经保护作用的药理机制为激活PI3K/Akt/mTOR通路。

综上所述，丙泊酚可降低脑缺血大鼠脑梗死体积，减轻神经炎性反应，抑制神经元变性、凋亡，修复受损脑神经功能，促使PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化激活是其药理机制之一。