乳腺癌组织17羟脱氢酶1、2、7型表达与病理特征及预后的相关性

常春艳 陈大千

在女性中，乳腺癌是最常见的癌症，也是导致癌症死亡的主要原因[1,2]。正常人乳腺组织的生长液是雌激素依赖性的并受到雌二醇(E2)增加的刺激[3]。流行病学研究表明，高水平的E2有助于细胞增殖和刺激癌症的发展[4,5]。17羟脱氢酶(17β-羟化类固醇脱氢酶，17β-HSDs)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH/NAD+)依赖性氧化还原酶，在雌激素和雄激素代谢中起重要作用[6]。目前已知17β-HSDs家族有15种亚型，可分为氧化亚型和还原亚型。还原亚型17β-HSDs如1型、3型、5型、7型和12型，利用NADPH作为辅助因子，将效力较低的雌激素转化为更有效的E2，而氧化亚型17β-HSDs如2型、4型、6型、8型、9型、10型、11型和14型则以NAD+作为辅助因子发挥逆转作用，将E2转化为效力较低的雌激素[7]。一般认为，乳腺癌细胞17β-HSDs同工酶表达水平的平衡对维持癌细胞足够的E2供应起着关键作用，它促进乳腺癌组织中雌激素受体(ER)阳性癌细胞的生长[2-7]。因此，检测17β-HSDs在乳腺癌中的表达对于更好地了解其在乳腺癌中的作用以及更好地了解乳腺癌雌激素作用的局部调节至关重要。本研究采用免疫组化方法检测1型、2型和7型17β-HSD在乳腺癌组织中的表达，以探讨其表达与临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年8月至2019年6月在南方科技大学医院行乳腺癌手术的80例患者的乳腺癌组织。所有患者术前未进行过任何治疗。从患者病历表收集每位患者的临床数据，包括患者性别、年龄、病理类型、肿瘤分期、肿瘤最大径、淋巴结转移数量、雌激素受体(ER)表达情况、孕激素受体(PR)表达情况、人表皮生长因子受体-2(HER2)表达情况以及细胞增殖抗原Ki67表达情况。入组患者均同意本研究中乳腺癌组织临床标本的采集。收集的乳腺癌组织临床标本均为在30 min内用预冷的4%多聚甲醛溶液固定24～48 h后经高浓度乙醇脱水、二甲苯清洗、石蜡包埋制成的乳腺癌组织石蜡样本。见表1。

1.2 免疫组化方法 将乳腺癌组织石蜡样本切成5 μm 厚切片，置于载玻片上脱蜡、水化，置于3%的过氧化氢-甲醇溶液中作用15 min，PBS冲洗后，滴加1∶500稀释的1型、2型或7型17β-HSD抗体，4℃下放置过夜。阴性对照组滴加兔同型对照抗体同样4℃放置过夜。4℃放置过夜后加入1∶200稀释的二抗，室温下孵育4 h，使用DAB-过氧化氢溶液浸泡5 min显色，苏木精复染30 s，自来水冲洗5 min，酸性乙醇溶液冲洗，再次自来水冲洗、乙醇及甲苯浸泡，封片。本研究所用试剂来源于上海联迈生物工程有限公司。

1.3 结果判断 组织切片结果的评价分别由2名研究人员独立完成，不同的评价结果最终由专家组共同阅片讨论决定，结果的评定依靠阳性细胞比例，不考虑组织染色强度。每个乳腺癌组织切片选取肿瘤细胞的强染色区，统计该区300个癌细胞的阳性细胞比例，当阳性细胞比例≥10%时记为表达阳性，阳性细胞比例<10%时记为阴性。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1型、2型和7型17β-HSD在乳腺癌组织中的表达情况

2.1.1 在80例乳腺癌患者中，49例(61.3%)患者乳腺癌组织的癌细胞胞浆可见1型17β-HSD表达，31例(38.7%)患者乳腺癌组织的癌细胞胞浆未见1型17β-HSD表达，1型17β-HSD阳性率为61.3%；52例(65%)患者乳腺癌组织的癌细胞胞浆检测到2型17β-HSD表达，28例(35%)患者乳腺癌组织未见2型17β-HSD表达，2型17β-HSD阳性率为65%；38例(47.5%)乳腺癌组织的癌细胞胞浆可见7型17β-HSD表达，42例(52.5%)乳腺癌组织未见7型17β-HSD表达，7型17β-HSD阳性率为47.5%。1型、2型和7型17β-HSD在乳腺癌组织中表达的免疫组化图见图1。

2.1.2 Spearman相关性分析发现，1型17β-HSD阳性与2型17β-HSD阳性呈负相关(r=-0.315，P=0.004)，而与7型17β-HSD阳性呈正相关(r=0.243，P=0.030)；2型17β-HSD阳性与7型17β-HSD阳性呈正相关(r=0.383，P<0.001)。

2.2 1型17β-HSD与各临床特征之间的关系 不同肿瘤分期患者的1型17β-HSD阳性率差异有统计学意义(χ2=12.827，P=0.004)；肿瘤最大径≤2 cm的患者的1型17β-HSD阳性率明显高于肿瘤最大径>2 cm 的患者，差异有统计学意义(χ2=9.404，P=0.003)；ER阳性患者的1型17β-HSD阳性率明显高于ER阴性患者，差异有统计学意义(χ2=31.354，P<0.00)；PR阳性患者的1型17β-HSD阳性率明显高于PR阴性患者，差异有统计学意义(χ2=27.322，P<0.001)；不同HER2状态的患者的1型17β-HSD阳性率差异显著(χ2=16.609，P=0.001)；不同Ki67状态的患者的 1型17β-HSD阳性率差异有统计学意义(χ2=10.039，P=0.002)。但是，不同年龄、不同病理类型或不同淋巴结转移数量的患者的1型17β-HSD阳性率均差异无统计学意义(均P>0.05)。Spearman相关性分析显示，乳腺癌组织中1型17β-HSD阳性与患者年龄、病理类型、淋巴结转移数量均无显著相关性(均P>0.05)，而与肿瘤分期(r=-0.339，P=0.002)、肿瘤最大径(r=-0.343，P=0.002)、HER2(r=-0.264，P=0.018)及Ki67(r=-0.354，P=0.001)呈负相关，与ER(r=0.626，P<0.001)和PR(r=0.584，P<0.001)呈正相关。见表2。

2.3 2型17β-HSD与各临床特征之间的关系 不同病理类型患者的2型 17β-HSD阳性率比较差异有统计学意义(χ2=9.905，P=0.004)，浸润性导管癌2型 17β-HSD阳性率显著高于浸润性小叶癌(69.3% vs.0)；不同肿瘤分期患者的2型 17β-HSD阳性率差异有统计学意义(χ2=25.654，P<0.001)；肿瘤最大径≤2 cm 的患者的2型17β-HSD阳性率明显低于肿瘤最大径>2 cm的患者，差异有统计学意义(χ2=5.416，P=0.033)；淋巴结转移数量分别为0、1～3、≥4的患者的2型 17β-HSD阳性率分别为31.0%、88.5%、80.0%，差异有统计学意义(χ2=23.469，P<0.001)；ER阳性患者的2型 17β-HSD阳性率明显低于ER阴性患者，差异有统计学意义(χ2=13.639，P<0.001)；PR阳性患者的2型17β-HSD阳性率明显低于PR阴性患者，差异有统计学意义(χ2=12.924，P<0.001)；不同HER2状态的患者的2型17β-HSD阳性率差异有统计学意义(χ2=7.990，P=0.045)。但是，不同年龄或不同Ki67状态的患者的2型17β-HSD阳性率比较差异无统计学意义(均P>0.05)。Spearman相关性分析发现，乳腺癌组织中2型17β-HSD阳性与患者年龄、HER2状态及Ki67状态均差异无统计学意义(均P>0.05)，而与浸润性导管癌(r=0.352，P=0.001)、肿瘤分期(r=0.457，P<0.001)、肿瘤最大径(r=0.260，P=0.020)及淋巴结转移数量(r=0.446，P<0.001)呈正相关，与ER(r=-0.413，P<0.001)和PR(r=-0.402，P<0.001)呈负相关。见表3。

表3 乳腺癌组织中2型17β-HSD与各临床特征的关系 例(%)

2.4 7型17β-HSD与各临床特征之间的关系 不同肿瘤分期患者的7型17β-HSD阳性率差异有统计学意义(χ2=29.835，P<0.001)；淋巴结转移数量分别为0、1～3、≥4的患者的7型 17β-HSD阳性率分别为31.0%、65.4%、48.0%，差异有统计学意义(χ2=6.490，P=0.038)；ER阳性患者的7型17β-HSD阳性率明显高于ER阴性患者，差异有统计学意义(χ2=7.607，P=0.009)；PR阳性患者的7型17β-HSD阳性率明显高于PR阴性患者，差异有统计学意义(χ2=4.521，P=0.042)。但是，不同年龄、不同病理类型、不同肿瘤最大径、不同HER2状态或不同Ki67状态的患者的7型17β-HSD阳性率比较差异无统计学意义(均P>0.05)。Spearman相关性分析显示，乳腺癌组织中7型17β-HSD阳性与肿瘤最大径(r=0.222，P=0.048)、ER(r=0.308，P=0.005)及PR(r=0.238，P=0.034)呈正相关，而与其他临床特征没有显著相关性(均P>0.05)。见表4。

表4 乳腺癌组织中7型17β-HSD与各临床特征的关系 例(%)

3 讨论

17β-HSDs家族中与乳腺癌相关的有1型、2型、7型等。1型17β-HSD催化非活性雌激素E1转化为生物活性形式E2。研究表明，1型17β-HSD通过酶转化E1在原位提供E2中起着关键作用，随后刺激雌激素依赖性乳腺癌细胞的生长[7,8]。1型17β-HSD在大多数人乳腺癌组织中均有表达[8,9]。与1型17β-HSD相反，2型17β-HSD表现出增强的氧化性17β-HSD活性，催化从E2到E1的转化。2型17β-HSD是人正常乳腺上皮17β-HSDs的显性亚型，其转化E2的活性比1型17β-HSD转化E1的活性高50倍，其通过调节E1和E2的平衡来保护正常乳腺上皮细胞。2型17β-HSD在乳腺癌组织中的表达水平仍存争议，有的报道2型17β-HSD表达在非增殖性病变中更常见，在癌症中并不常见；有的则报道2型17β-HSD表达在癌组织中上调[9]。7型17β-HSD具有还原性17β-HSD活性并将E1转化为E2。7型17β-HSD可在包括正常乳腺在内的多种人体组织中检测到[9]。

本研究通过免疫组化检测发现，1型、2型和7型17β-HSD在乳腺癌组织中的阳性率分别为61.3%、65%和47.5%，表明1型、2型和7型17β-HSD在人类乳腺癌组织中普遍表达。本研究显示，1型17β-HSD阳性与2型17β-HSD阳性显著负相关，与7型17β-HSD阳性显著正相关；这一结果符合2型17β-HSD和1型17β-HSD在E1和E2相互转化中的作用相反，7型17β-HSD和1型17β-HSD在E1和E2相互转化中的作用类似。但是，本研究中2型17β-HSD阳性与7型17β-HSD阳性显著正相关，这与2型17β-HSD和7型17β-HSD在E1和E2相互转化中的作用相反不相符。推测造成这种矛盾的原因可能在于1型、2型17β-HSD是负责E1和E2相互转化的主要的酶，而7型17β-HSD虽然也可在E1和E2相互转化中发挥作用，但其主要生物学功能可能并不在于此；因此，在E1和E2相互转化中，1型17β-HSD表达可能制约着7型17β-HSD表达，导致部分1型17β-HSD阳性乳腺癌组织中7型17β-HSD表达缺失，进而导致7型和2型17β-HSD在乳腺癌组织中的表达存在一致性。

本研究发现，ER阳性患者的1型17β-HSD阳性率明显高于ER阴性患者，PR阳性患者的1型17β-HSD阳性率明显高于PR阴性患者，Ki67阳性患者的1型17β-HSD阳性率明显低于Ki67阴性患者；Spearman相关性分析显示，乳腺癌组织1型17β-HSD阳性与ER、PR显著正相关，而与Ki67显著负相关。ER、PR被认为是判断乳腺癌预后、治疗指导的重要指标；ER/PR阳性乳腺癌可接受内分泌治疗，并预示预后良好[10]。本研究中乳腺癌组织1型17β-HSD阳性与ER、PR的正相关关系表明乳腺癌组织1型17β-HSD状态可能反映其ER、PR状态，提示1型17β-HSD可能作为判断乳腺癌预后、治疗指导的潜在标志物。Ki67是一个重要的细胞增殖标志物。一般来说，在大多数新辅助化疗的乳腺癌病例中，残余肿瘤的Ki67表达水平降低[10]。因此，Ki67可以用来反映乳腺癌化疗治疗的效果，可作为化疗敏感性指标。本研究中乳腺癌组织1型17β-HSD阳性与Ki67呈负相关关系，表明1型17β-HSD阳性预示着Ki67低表达或阴性；因此，1型17β-HSD可能作为化疗治疗效果的潜在预测指标。

此外，本研究结果显示，乳腺癌组织中1型17β-HSD阳性与肿瘤分期、肿瘤最大径显著负相关，提示随着肿瘤恶性程度的升高、肿瘤最大径的增加，1型17β-HSD阳性率下降；也就是说，1型17β-HSD阳性通常出现在恶性程度较低、肿瘤较小的乳腺癌患者中。本研究还发现，乳腺癌组织中1型17β-HSD阳性与HER2呈负相关关系。HER2状态对于指导抗HER2治疗改善乳腺癌预后和避免过度治疗至关重要[10]。本研究结果表明1型17β-HSD阳性可能预示着HER2低表达或阴性，提示1型17β-HSD可能是抗HER2治疗的潜在预后标志物。

本研究发现，乳腺癌组织中2型17β-HSD阳性与浸润性导管癌、肿瘤分期、肿瘤最大径及淋巴结转移数量显著正相关，与ER和PR显著负相关；表明浸润性导管癌相比浸润性小叶癌更可能出现2型17β-HSD阳性；2型17β-HSD阳性通常出现在恶性程度高、肿瘤较大、淋巴结转移数量较多、ER阴性或PR阴性的乳腺癌患者中。另外，乳腺癌组织中2型17β-HSD阳性与ER和PR的负相关关系可能提示乳腺癌组织2型17β-HSD阳性患者可能不适合接受内分泌治疗，预示着内分泌治疗预后不良。

本研究还发现，乳腺癌组织中7型17β-HSD阳性与肿瘤最大径、ER和PR显著正相关。本研究结果表明，7型17β-HSD阳性通常出现在肿瘤较大、ER阳性或PR阳性的乳腺癌患者中；7型17β-HSD阳性与ER和PR的正相关关系可能提示乳腺癌组织7型17β-HSD表达与ER、PR的表达存在一致性，乳腺癌组织7型17β-HSD阳性患者可能适合接受内分泌治疗，预示着内分泌治疗预后良好，7型17β-HSD可能作为判断乳腺癌预后、治疗指导的潜在标志物。

综上，本研究发现1型、2型和7型17β-HSD在人类乳腺癌组织中普遍表达，并证明了乳腺癌组织中1型、2型和7型17β-HSD表达与乳腺癌患者各临床病理特征的相关性。因此，检测1型、2型和7型17β-HSD在乳腺癌中表达，有助于提高对乳腺癌恶性表型判断的准确性，可帮助深入了解肿瘤发生发展机制，并可为乳腺癌预后判断和治疗决策提供依据。