氟化钠对心肌细胞LC-3、Beclin-1、STAT-3表达的影响*

闫 烁，马宝慧

(1.内蒙古科技大学包头医学院2018级研究生，内蒙古 包头 014040；2.内蒙古科技大学包头医学院生理学教研室；3.内蒙古科技大学包头医学院神经科学研究所)

氟是一种广泛存在于自然界中的元素，通常以化合物形式存在。人体摄入氟的主要来源包括饮水、饮茶、燃煤等，不同地区的人摄取氟的途径各不同。一定量的氟对人体有益，如预防龋齿。但是，当氟积累到一定程度后就会对全身各个器官造成损伤，包括骨相损伤和非骨相损伤。全世界有50多个国家和地区都存在氟化物超标的问题[1]。越来越多的研究表明，氟化物在体内积累，对心血管等许多系统产生毒害作用，从而导致心室舒张功能障碍、外周血管疾病、主动脉粥样硬化和缺血性心脏病[2]。

目前研究证实，过量摄入氟化物会对人体造成伤害，因此对其损害机制的研究就变得尤为重要。研究表明，过量氟化物的摄入会引起细胞内活性氧的产生，过氧化损伤不仅能够通过活性氧的直接作用造成肾损伤，还能导致下游凋亡、自噬等多种生物学行为。组织器官功能的损伤过程不仅涉及细胞过度凋亡，同时还与细胞过度自噬密切相关[3]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是调节自噬过程最重要的上游信号分子。缺氧、氧化应激、中毒等外界刺激可激活mTOR信号通路所介导的细胞自噬过程，增加哺乳动物ATG6同源蛋白(Beclin-1)的表达，并与多种Atg分子相互作用，参与自噬体的形成。微管相关蛋白1轻链3(LC-3)是自噬过程激活的标志分子，自噬未激活时，LC-3及LC-3Ⅰ为主要存在形式，自噬激活时，LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ转化。信号转导与转录激活因子3(STAT-3)可以被不同的细胞因子激活，在细胞因子-受体相互作用的过程中充当载体，在细胞的生长、分化中起着重要作用。在生理性自噬过程中，细胞利用自身的溶酶体来降解受损的细胞器及大分子，既能清除损伤的大分子及细胞器，又能通过降解产物为细胞供能。但外界损伤因素的持续存在会造成自噬过程持续激活，进而造成细胞发生损伤。本文利用大鼠H9c2心肌细胞建立氟中毒模型，研究不同浓度的氟化钠对心肌细胞中自噬相关基因的变化。

1 对象与方法

1.1实验材料及分组 选用大鼠H9c2心肌细胞，购于北京协和医学院细胞资源中心国家实验细胞资源共享服务平台。H9c2心肌细胞分为6组，分别为0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L NaF组，各组均用相应的培养基培养48 h。

1.2方法 样品中加入200 μL的Trizol，匀浆研磨成无颗粒状，再以加入80 μL Trizol的针管来回抽吸，静置5 min，4 ℃，12 000 g离心5 min。取上清加氯仿，4 ℃，12 000 g离心15 min。取上清加等比例异丙醇，4 ℃，1 000 g离心5 min。弃上清加预冷的75 %乙醇1 mL，4 ℃，10 000 g离心5 min。弃上清4 ℃，7 500 g空转1 min。加入20 μL dd H2O溶解RNA，震荡、离心，测定RNA浓度。反转录得到cDNA，于PCR仪扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检验。LC-3、Beclin-1、STAT-3 mRNA表达分析采用Tanon-500全自动化学发光图像分析系统。

1.3实验仪器及试剂 Nanodrop-2000微量核酸蛋白定量仪(美国Thermo Scientific)，2×Taq PCR预混试剂Ⅱ(天根)，PCR仪(美国Thermo Scientific)，Trizol细胞裂解液，氯仿，异丙醇，75 %乙醇，Thermo反转录试剂盒(美国Thermo scientific)。

1.4统计分析 所有数据采用SPSS 20.0进行分析。计量资料以(均数±标准差)表示，采用单因素方差分析进行统计，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1氟化钠对心肌细胞LC-3、Beclin-1 mRNA表达的影响 将H9c2心肌细胞加入含有NaF的培养基培养48 h后，心肌细胞LC-3和Beclin-1 mRNA表达量随培养基中NaF浓度的增加而增加，见图1-a、1-b。

图1 氟化钠处理心肌细胞48 h后LC-3 mRNA、STAT-3 mRNA、Beclin-1 mRNA表达量的变化

2.2氟化钠对心肌细胞STAT-3 mRNA表达的影响 H9c2心肌细胞在染毒处理48 h后，STAT-3 mRNA表达量随培养基中NaF浓度的增加而减少，见图1-c。

3 讨论

氟是卤族元素中化学性质较活泼的元素之一，是机体必需的微量元素，具有强负电性、高度破坏性。过量的氟可对机体软组织系统造成损伤。心肌是氟中毒非骨相损伤非常重要的靶器官之一。越来越多的证据表明，心血管系统易摄入过量的氟化物，导致严重的功能障碍，例如心输出量下降，诱发心律不齐和心脏传导阻滞[4]。高浓度的氟化物可引起心肌细胞损伤，导致心室舒张功能障碍、周围血管疾病、颈动脉粥样硬化和缺血性心脏病。然而，人们对氟中毒致心血管疾病发生的作用机制尚不清楚。我们前期的实验结果表明，染毒的心肌细胞活力降低。

自噬是近年来生命科学领域研究的热点。自噬是细胞通过一系列复杂过程将自身组成成分或外来入侵者进行消化的过程，是细胞维持稳态、抵抗逆境的一个重要机制。自噬是机体细胞的一种程序性死亡方式，也称为Ⅱ型程序性死亡，参与细胞增殖、生长、凋亡、维持细胞内环境稳态。LC-3是哺乳动物细胞中自噬体的标记蛋白，是目前观察自噬现象是否存在，研究细胞自噬较为可靠的生物学标志物[5]。在哺乳动物细胞内，LC-3与ATG8是同源基因，LC-3的表达水平越高，则自噬水平越高。哺乳动物中Beclin-1是参与自噬的另一种特异性基因，其与Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(class-3-PI3K)形成复合物，从而参与自噬体的形成[6]。正常情况下，机体的自噬水平处于较低的范围，当机体受到某种刺激或处于应激状态时，即被诱导发生自噬。不同程度的自噬对细胞的作用有很大区别，当自噬发生程度低时自噬会对细胞产生保护作用，而过度自噬发生时会对细胞造成损伤[7]。本实验以H9c2大鼠心肌细胞为实验材料，将H9c2细胞分别加入到含有2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L NaF的培养基中培养48 h后，H9c2心肌细胞中LC-3和Beclin-1 mRNA表达量随NaF浓度的增加而增加，且高于对照组。徐淋等[8]研究显示，氟中毒大鼠肝脏中LC-3、Beclin-1、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白细胞基因伴随蛋白x(Bax)的蛋白表达水平明显高于对照组，说明过量氟可激活大鼠肝组织中自噬和凋亡因子，自噬和凋亡可能共同参与慢性氟中毒所致肝脏损伤的发病过程。以前研究表明，细胞凋亡可能参与氟中毒引起的心肌细胞损伤，推测在氟致心肌细胞损伤时还有自噬的参与。

STAT-3是STATs家族的重要成员，也是细胞因子和生长因子信号途径的介导子。STAT-3广泛表达于不同类型的细胞和组织中，参与细胞生长分化、增生、恶性转化及凋亡抑制等生理功能的调控[9]。刘亚丽等[10]及俞辰斌等[11]研究显示，STAT-3是调控细胞生长、分化的重要因子，缺血再灌注损伤的心肌细胞及氧化应激损伤的心肌细胞p-STAT3表达下调，激活大鼠心肌细胞JAK2/STAT3信号通路能够抑制心肌细胞凋亡，发挥心肌细胞的保护作用，阻断STAT3的激活则增加细胞凋亡，细胞活力明显下降。在本实验中，STAT-3 mRNA表达量随NaF浓度的增加而降低，低于对照组，表明过量的氟可诱导自噬产生，同时在细胞生长、分化中起着重要作用的STAT-3相对表达量下降，我们推测氟中毒可能引起自噬从而使心肌细胞活力降低。

综上所述，过量的氟化物上调心肌细胞LC-3、Beclin-1 mRNA表达量，并下调STAT-3 mRNA表达量，推测氟化钠导致心肌细胞活力降低可能与自噬的过度激活有关。