热原检查中家兔注射细菌内毒素后的升温情况考察

李杨，张晓杰，尹敏，王立增，曹大伟，郑霞

1.山东泰邦生物制品有限公司，山东 泰安 271000；2.泰安市妇幼保健院，山东 泰安 271000

热原是能引起恒温动物产生异常升温情况的致热物质的总称。热原在注射入人体后可能会引起寒战、发烧、呕吐等情况，甚至会威胁生命，热原检查对于静脉注射类药品质量的控制尤为关键。药典规定的热原检查法是家兔法热原检查和细菌内毒素检查法热原检查。家兔法热原检查是将一定剂量的待检药品通过家兔静脉注射入家兔体内，通过家兔体温变化情况判定检测药品中是否含有热原，家兔具有与人类相似的发热机理［1］，并且与能引起人类发热的最小细菌内毒素的剂量基本一致。家兔法热原检查反映出的各种热原在机体中的表现与临床反应相近，适用于检查较多种类的热原物质，是我国药品和生物制品质量评价中常用的热原检查方法［2］。细菌内毒素是药品生产中最常见、危害最大的一类热原物质，也是热原检查的主要目标。鲎试剂法仅能检测细菌内毒素，不能检测其他种类的热原［3］。本研究将不同剂量的细菌内毒素注射入家兔静脉，统计家兔的升温情况，考察内毒素剂量与家兔升温之间的关系，提高试验的准确性与可靠性。

1 材料与方法

1.1 实验器材

电热恒温鼓风干燥箱（山东潍坊精鹰医疗器械有限公司，型号：立鹤牌 502 型），低压漩涡搅拌机（赛默飞世尔科技有限公司，型号：G8KT18057），微机热原测定仪（上海辽卓科贸有限公司，型号：WRY-2015 型），热原测定程序（上海辽卓科贸有限公司，型号：Pyrogen Test Expert 2015），10 mL 注射器（山东新华医疗器械股份有限公司，批号：190615）。

1.2 实验试剂

细菌内毒素工作标准品（湛江安度斯生物有限公司，规格：10 EU/支，批号：1905311），细菌内毒素检查用水（湛江安度斯生物有限公司，规格：5 mL/支，批号：1904250），氯化钠注射液（0.9%生理盐水，重庆三大伟业制药有限公司，批号：20190831）。

1.3 实验用家兔

普通级家兔24 只，品种为新西兰大白兔，体质量1.7～3.0 kg，实验动物生产许可证：SCXK（鲁）2018-0001，实验动物使用许可：SYXK（鲁）2018-0001，饲养条件：温度17～25 ℃，湿度40～70%。家兔按照《中国药典》2015 版通则中热原检查法进行预选。

1.4 器材准备

基于本公司验证的除热原程序，将安瓿瓶用锡箔纸包住，置于电热恒温鼓风干燥箱中，240 ℃，干烤2 h，除去热原。

1.5 细菌内毒素供试液制备

取10 EU/支的细菌内毒素工作标准品15 支，分别用1 mL 细菌内毒素检查用水复溶，封口膜包好，置于旋涡震荡仪上震荡15 min，用0.9%氯化钠注射液将内毒素配成0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 EU/mL 的溶液，按家兔体质量每1 kg 注射1 mL，即家兔内毒素注射剂量分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 EU/mL 的内毒素供试液。

1.6 热原检查家兔法

1.6.1 家兔预选 选择1.7～3.0 kg 的新西兰大白兔，健康无异常。预测体温前7 d 用同一批饲料喂养，在此期间，体质量无减轻，精神、食欲、排泄等无异常情况。本次试验是采用未经任何试验的家兔，按照《中华人民共和国药典》通则1142［4］，每隔30 min 测温1 次，共测温8 次。选用家兔体温均在38.0～39.6 ℃之间，且温差不超过0.4 ℃的家兔。

1.6.2 试验步骤 24 只家兔分为8 组，每组3 只，分别将0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 EU/mL的溶液，按家兔体质量每1 kg 注射1 mL，每个剂量注射3 只家兔，生理盐水作为空白对照组，同样每1 kg 家兔注射1 mL，注射3 只家兔，注射后每30 min 测温一次，共测温6 次，观察注射后3 h 家兔的升温情况。按照《中华人民共和国药典》通则1142［4］进行结果判定。

2 结果

空白对照（CK）组，0.25 EU/kg 组和0.5 EU/kg组温度比较平稳，基本无升温现象。1 EU/kg 组的家兔，三只家兔温度稍有波动，但个体升温和升温总和均符合药典规定。2 EU/kg 组的家兔，有一只家兔升温超过0.6 ℃。2.5 EU/kg 组的家兔，有一只家兔升温超过0.6 ℃，升温总和超过1.3 ℃。5 EU/kg 组的家兔，2 只家兔升温超过0.6 ℃，且升温总和超过1.3 ℃。0.5 EU/kg 至10 EU/kg 的注射剂量存在明显的剂量关系，见表1、图1。

图1 细菌内毒素注射剂量与家兔体温升温总和的关系

3 讨论

从本次实验的数据发现，家兔在0.5 EU/kg 的内毒素注射剂量以下，家兔均没有明显的升温现象；内毒素注射剂量在1 EU/kg 及以上时，家兔的体温有明显的升高，升温存在个体差异，在同一注射量下，家兔的升温差异很大，可达到0.58 ℃。

本次试验热原检查家兔法内毒素灵敏度为大于5 EU/kg，家兔总体均有明显升温，内毒素注射剂量与家兔升温度数存在剂量关系。内毒素注射剂量在家兔升温阈值之上时，组内家兔至少有2 只升温超过0.6 ℃。

从本次实验的结果分析，家兔的个体因素对实验的影响较大，家兔并不是稳定的化学试剂，不同家兔对内毒素的灵敏度均有差异，实验室洁净度，实验人员的注射手法，家兔的基础体温等都对实验结果有影响［5-6］。因此家兔法检测热原的方法，仅能检测供试品所含热原是否超过质量标准的限度，不能从家兔的升温度数确定内毒素的含量。如家兔法热原检查初试结果偏高，进行复试后结果仍旧偏高，基本可以排除家兔个体差异的因素，可以从其他方面探究原因。

探究内毒素注射剂量与家兔升温值之间关系，虽然不能确定内毒素的具体含量，但是能大致推测内毒素含量的区间范围，对企业药品质量控制提供了一定的参考依据。实际生产中，若产品热原检查结果数值虽符合药典质量标准，却呈现较高的趋势时，应考虑其热原水平是否较高的可能，并需要引起足够的重视。

表1 注射不同剂量细菌内毒素后家兔体温变化

家兔法热原检查和细菌内毒素检查法热原检查是目前应用最广泛的两种热原检查方法，但是有其固有的缺点，相关药品企业可以采用两种方法结合检测药品中热原含量是否超过限度，提高药品质量，维护病人用药安全。目前，包括全血法、单核细胞系法与人外周血单个核细胞在内的体外热原检查法得到了广泛研究，研究建立单核细胞法代替上述两种传统热原检测方法是热原检测领域发展的整体趋势［7-8］。

由于现有方法的局限性，我们并不能直接根据家兔的升温情况判定热原的含量，随着人们对热原物质的不断认知，发热机理的进一步认识，生物学技术的发展与应用，以及检测方法的不断提高，可能会有灵敏度、准确度更高的方法准确检测出供试品中热原的种类与含量，大大提高检测人员的检测效率，增加用药安全。