泸州老窖大曲中高产纤溶酶菌株的分离及鉴定

张立强，冉茂芳，王松涛，刘光钱，马 卓，任剑波，沈才洪，许 涛

(1.泸州品创科技有限公司，四川泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000)

血栓疾病是一种由大量纤维蛋白和血小板凝集造成的严重性血管疾病，主要分为动脉性、静脉性和毛细血管性血栓，常常会引起人体中风、脑梗死、心源性猝死等疾病。随着生活节奏的加快及工作压力的增加，人们的饮食和作息规律发生改变，血栓发病率逐年增加，严重威胁人类的身体健康[1-2]。治疗血栓疾病主要有外科手术、抗血小板凝集、抗凝血药及纤溶酶（链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂）等4 种疗法，但是，这些疗法费用高昂、用量大、半衰期短、专一性差、副作用较多且医疗效果有限[3]。1987 年，日本科学家Sumi 等[4-5]首次从日本纳豆中发现了纳豆激酶，一种具有很高纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，不仅可以直接分解纤溶蛋白，而且可以刺激细胞释放组织纤溶酶原激活剂。与其他纤溶酶如尿激酶、链激酶及其他溶栓药物相比，纳豆激酶具有安全性高、成本低、纤溶活性强、可口服和作用时间长等优点[6]。纳豆激酶的发现将纤溶酶的筛选来源引向了微生态环境，经过30 多年的研究，产纤溶酶的微生物尤以耐热的芽孢杆菌为最多，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等[1]。芽孢杆菌合成的纤溶酶为丝氨酸及金属肽酶，可以水解纤维蛋白、纤维蛋白原和合成的物质，在pH5～12 及10～75 ℃条件下仍保持一定的活性[7]。

大曲为白酒酿造过程中的酶制剂、微生物及香味物质来源，分低温大曲、中温大曲和高温大曲。泸州老窖大曲为中高温大曲，其发酵顶温可达50～60 ℃，经过发酵，其中富集了大量的耐热芽孢杆菌，可合成大量的淀粉酶、蛋白酶等水解酶类。此外，其代谢合成的生理活性物质如吡嗪类化合物、地衣素、氨基酸活性短肽等可能会通过蒸馏进入到白酒中，使白酒具有一定的养生保健功能[8-9]。因此，中高温大曲中可能存在潜在的合成耐受性较高的纤溶酶的微生物。本研究拟以泸州老窖中高温大曲为样品，从中筛选纤溶活性较高的芽孢杆菌，为溶栓药物的开发、功能性保健酒及保健食品的开发提供功能性微生物资源，有利于充分挖掘酿酒微生物资源和揭示白酒预防动脉粥样硬化等的养生保健功能。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：中高温大曲，泸州老窖股份有限公司。

试剂及耗材：氢氧化钠、葡萄糖、麦芽糖、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、酵母提取物、虾壳粉、氯化钠、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、番红、乙醇、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙分析纯，本地化学试剂商店；琼脂糖Sigma-Aldrich；脱脂牛奶、牛血纤维蛋白原、尿激酶、牛凝血酶，上海源叶生物科技有限公司；Tris-HCl、DNA 提取液、蛋白酶K、蜗牛酶、溶菌酶、Tris-HCl、EDTA、CTAB，上海生工生物工程有限公司；VITEK-2 革兰氏阳性芽孢杆菌鉴定卡，法国梅里埃公司。

仪器设备：超净工作台SW-CJ-2G，上海诺萱科学仪器有限公司；高速冷冻离心机CR22N，日本日立；高压灭菌锅344，日本三洋；恒温摇床培养箱，上海世平实验设备有限公司；水浴锅HH-6，金城硕华仪器厂；VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统，法国梅里埃公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基和溶液

初筛培养基[10]：脱脂奶粉6.0%、牛肉膏0.5%、蛋白胨0.5 %、氯化钠0.5%、琼脂1.5 %～2.0 %，pH7.0，115 ℃灭菌15 min。

复筛培养基：琼脂糖-纤维蛋白原平板。

斜面培养基（LB 固体培养基）：胰蛋白胨1.0 %、酵母提取物0.5 %、氯化钠1.0 %、琼脂1.5%～2.0%，pH 7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：蛋白胨1.0%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1 %，麦芽糖2.0 %，酵母提取物1.0 %，葡萄糖0.2%，虾壳粉1.0%，脱脂牛奶2.0%，pH7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。

磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，PBS，pH7.2）：将72.0 mL 0.2 mol/L 的Na2HPO4水溶液与28.0 mL 0.2 mol/L 的NaH2PO4水溶液混匀，配制成0.2 mol/L的PBS，121 ℃灭菌20 min。

工作液：将0.2 mol/L 的PBS 用无菌水稀释成0.01 mol/L 的PBS，然后，准确量取100.0 mL 与1700.0 mL 的0.9 %无菌生理盐水混匀配制成工作液。

凝血酶溶液：将1240 U 的牛凝血酶加入到1.24 mL 无菌超纯水中，充分溶解后配成母液。然后，准确量取1.0 mL母液，用0.9%的无菌生理盐水定容到100 mL 配制成10 U/mL，保藏于-20 ℃待用。

纤维蛋白原溶液：准确称取一定量的牛血纤维蛋白原溶液溶于工作液中配制成1.50 mg/mL 的纤维蛋白原溶液。纤维蛋白原溶液需现配现用，使用前，于55 ℃水浴中预热1 min。

琼脂糖溶液：准确称取5.40 g 琼脂糖溶于360 mL 工作液中，分装到20 支大试管中，每支分装18 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 高产纤溶酶菌株的初筛

称取5.00 g 中高温大曲样品，置于盛有45 mL无菌生理盐水且底部铺满玻珠的250 mL 三角瓶中，80 ℃水浴处理10～15 min 后，180 r/min 振荡摇匀30 min，获得菌悬液。菌悬液用无菌生理盐水梯度稀释后，取10-6、10-7、10-8的稀释液0.2 mL，加入到无菌培养皿中。然后，将冷却到50 ℃左右的初筛培养基注入到含有稀释液的培养皿中，使培养基铺满皿底即可，充分混匀后，静置凝固15 min，于37 ℃条件下倒置培养24 h。从培养皿中挑选菌落形态不同且水解圈较大的菌落，在初筛培养基平板上进行连续划线分离至纯，挑取水解圈较大的单菌落，保藏到斜面培养基，编号为QM1～QM13。然后，将微生物在初筛培养基上分3 个区域接种，以37 ℃培养12 h，观察其菌落形态，并经革兰氏染色观察细胞形态。

1.2.3 高产纤溶酶菌株的复筛

1.2.3.1 纤溶酶粗酶液的制备

用接种环挑取2～3 环斜面培养基上的菌落到50 mL LB 液体培养基中，37 ℃条件下180 r/min 活化培养18 h，用血球计数板计数后，调整菌浓为1.0×108cfu/mL。然后吸取1 mL 接种到24 mL 发酵培养基中，37 ℃条件下180 r/min 培养24 h。将发酵液8000 r/min 冷冻离心（4 ℃）5 min，收集上清液获得纤溶酶粗酶液。

1.2.3.2 琼脂糖-纤维蛋白原平板的制备[11]

将装有18 mL 1.5%琼脂糖的试管放入沸水浴中使琼脂糖完全溶解，冷却至50～55 ℃。准确加入2 mL 牛血纤维蛋白原溶液(1.50 mg/mL)，充分振荡混匀后倒入无菌培养皿中（Φ：9 cm）。然后，迅速加入1 mL 牛凝血酶溶液(10 U/mL)，轻轻晃动培养皿使其充分混匀，静置1 h 后，用直径2 mm 的无菌打孔器在平板上均匀打3个孔。

1.2.3.3 尿激酶标准曲线

将尿激酶标品用无菌水稀释成1000 IU/mL、800 IU/mL、600 IU/mL、400 IU/mL、200 IU/mL 和100 IU/mL 等6 个梯度的标准液。准确吸取10 µL尿激酶标准液注入琼脂糖-纤维蛋白原平板孔中，一个浓度做3个平行。然后，静置吸附15～20 min，37 ℃培养18 h，从3 个方向用游标卡尺测定溶解圈的直径，取平均值计算各溶解圈面积（mm2）。以溶解圈的面积为横坐标（x），以尿激酶酶活为纵坐标（y），制作尿激酶标准曲线。

1.2.3.4 纤溶酶活力的测定

准确吸取10µL 纤溶酶粗酶液注入琼脂糖-纤维蛋白原平板孔中，一个浓度做3 个平行。然后，静置吸附15～20 min，37 ℃培养18 h，从3 个方向用游标卡尺测定溶解圈的直径，取平均值计算各溶解圈面积，由尿激酶标准曲线计算纤溶酶的活力。

1.2.4 高产纤溶酶菌株的鉴定

1.2.4.1 生理生化实验鉴定

利用VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统对纤溶酶活性较高的菌株进行生理生化实验鉴定。具体流程如下：将纤溶酶活性较高的菌株接种到斜面培养基上，37 ℃条件下培养12 h，用无菌接种环挑取菌体到装有3 mL 的0.9 %无菌生理盐水的小试管中，涡旋振荡打散后，用无菌生理盐水将菌浓调整到0.3～0.5 麦氏浊度。然后，将小试管放到卡架上与VITEK-2 革兰氏阳性芽孢杆菌鉴定卡连接，把卡架放入仪器填充室中进行自动填充并放入到培养室中培养检测。最后，将鉴定卡信息录入到VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统工作站，培养检测14～15 h 后经工作站导出生理生化反应结果及最终的鉴定结果。

1.2.4.2 16S rDNA测序鉴定

为进一步鉴定纤溶酶活性较高的菌株，将菌株接种到LB 液体培养基中，37 ℃培养12 h 后，10000 r/min 冷冻离心（4 ℃）10 min，去除上清液收集菌体。然后，用传统DNA 提取方法提取微生物的基因组DNA[8]，经核酸蛋白仪测定浓度及纯度后移交上海生工生物工程有限公司测定16S rDNA 全长序列。

表1 分离的细菌的菌落形态

1.3 数据处理

利用Adobe Photoshop 软件对菌落图及革兰氏染色图进行处理。使用OriginPro 9.0 软件绘制尿激酶标准曲线。使用SPSS statistics 19.0 软件对不同菌株的纤溶酶活力进行显著性分析。菌株的16S rDNA 序列经NCBI 网站Blast 功能检索同源性序列，然后利用MEGA-X软件作系统发育树分析。

2 结果与讨论

2.1 高产纤溶酶菌株的初筛、菌落形态及细胞形态

纤溶酶是一种丝氨酸肽链内切酶，可以水解初筛培养基中的酪蛋白形成水解圈[7，12]。基于此，从中高温大曲中初步筛得13 株酪蛋白水解活力较高的细菌，编号为QM1—QM13（表1）。将13 株细菌分别接种到初筛培养基平板上，培养后观察其菌落形态，如表1 所示，QM1、QM2、QM3、QM4、QM6、QM7、QM8、QM9 和QM10 的菌落形态一致，均为乳白色、圆形、边缘整齐、颗粒感、致密、有褶皱突起、黏液少、不透明，与培养基结合紧密，可能为同一种细菌。QM5 的菌落形态为乳白色、边缘不规则、颗粒感、不致密、褶皱凸起、黏液较多、不透明、与培养基结合较紧密，可能为另一种细菌。QM11、QM12 和QM13 的菌落形态一致，与其他微生物的菌落形态差异明显，为米白色、边缘不规则、光滑、不致密、凸起、黏液很多、微透明，与培养基结合较紧密，可能为同一种细菌。部分细菌的菌落图如图1 所示。为进一步研究各细菌的细胞形态，经革兰氏染色后，油镜下观察其形态，如表2 所示。结果表明，筛得的细菌均为革兰氏阳性芽孢杆菌、短杆、单联或二联，孢子为椭圆形中生孢子。部分微生物的革兰氏染色图如图2所示。

图1 分离的细菌的菌落形态图

2.2 高产纤溶酶菌株的复筛

2.2.1 尿激酶标准曲线

不同酶活梯度的尿激酶标准液在琼脂糖-纤维蛋白原平板上反应结束之后，以溶解圈直径的平均值计算的面积为横坐标（x，mm2），以尿激酶酶活为纵坐标（y，IU/mL），绘制尿激酶标准曲线，如图3 所示。拟合的线性回归方程为y=0.1041x+5.9879，R2=0.9919，结果表明，方程线性关系良好，可用于纤溶酶活性的测定。

2.2.2 芽孢杆菌的纤溶酶活力

表2 分离的细菌的细胞形态

图2 分离的细菌细胞形态图

图3 尿激酶酶活标准曲线

将10 μL 纤溶酶粗酶液加入到琼脂糖-纤维蛋白原平板孔中，培养至与尿激酶反应时间一致后，用游标卡尺测定3 个平行的水解圈直径，计算水解圈的面积。然后，经尿激酶标准曲线计算各纤溶酶粗酶液的纤溶酶活力（均值±标准偏差，IU/mL），如图4 所示。结果表明，不同芽孢杆菌发酵液的纤溶酶活力差异显著性（p＜0.05），QM12 和QM5的纤溶酶活力最高，分别为4270.83 IU/mL±563.52 IU/mL和3711.48 IU/mL±418.93 IU/mL，其次为QM4（3508.84 IU/mL±531.72 IU/mL），QM1 和QM7 的最低，分别为2379.71 IU/mL±69.38 IU/mL 和2447.82 IU/mL±53.79 IU/mL。目前，研究学者主要从纳豆[13-14]、豆豉[15]、臭豆腐[11]、豆酱[16]、鹰嘴豆[17]和土壤[2，18]等微生态环境中筛选高产纤溶酶的菌株。但是，文献中的纤溶酶活力的单位众多，如FU/mL、U/mL、IU/mL、FU/g、U/mg、mU/mg 等[1，18]，难以比较不同菌株间的酶活力大小。酶活力单位为IU/mL的菌株的纤溶酶活力多为300～2100 IU/mL[19-24]，极少数菌株通过发酵条件优化、诱变育种或基因改造可使纤溶酶活力达到4000～5500 IU/mL[25-26]。本研究从中高温大曲中筛选的芽孢杆菌的纤溶酶活力均＞2400 IU/mL，且为野生型菌株，未进行培养基及发酵条件优化，表明筛选的芽孢杆菌为高产纤溶酶菌株，特别是QM5 和QM12。Nidialkova 等[7]指出芽孢杆菌合成的纤溶酶为丝氨酸及金属肽酶，可以水解纤维蛋白、纤维蛋白原和合成的物质，可在pH5～12 及10～75 ℃条件下保持活性。白酒中也检出了一定含量的地衣素、脯氨酸-组氨酸-脯氨酸等的活性肽，表明这些物质可经过蒸馏进入到白酒中，并保有一定的功能活性[9]。本试验从酿酒大曲中筛得纤溶酶活力较高的芽孢杆菌，有利于揭示白酒的预防动脉粥样硬化等养生保健作用，后续研究工作仍需要对这些纤溶酶的种类进行系统性研究。

图4 分离的芽孢杆菌纤溶酶活力

2.3 高产纤溶酶芽孢杆菌的菌种鉴定

2.3.1 生理生化鉴定

VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统可有效对微生物进行鉴定[27]，经该方法对纤溶酶活力最高的两株芽孢杆菌QM5 和QM12 进行了鉴定，其生理生化反应结果见表3。QM5 菌株的β-木糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶和丙酮酸盐反应呈现阳性，而QM12 的则呈现阴性，其次，QM12 的L-赖氨酸芳胺酶、亮氨酸芳胺酶、β-半乳糖苷酶、丙氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、环糊精、糖元、己醇、ELLMAN、麦芽三糖、氨基酸芳胺酶、N-乙酰-D-葡萄糖氨、α-葡萄糖苷酶、D-塔格糖、红四氮唑、多粘菌素B 耐受反应呈现阳性，QM5 则呈现阴性。QM5 与QM12 的其他反应结果一致。结果表明，QM5 和QM12 生理生化反应差别明显，为两种不同的芽孢杆菌，与形态学观察结果一致。QM5 BCL 卡鉴定编码为1260140415446220，结果为Bacillus amyloliquefaciens，为可接受的鉴定结果。QM12 BCL 卡鉴定编码为2373271755076261，结果为Bacillus licheniformis，可信度达96 %，为很好的鉴定结果。

2.3.2 16S rRNA鉴定

为进一步鉴定QM5 和QM12 的种属，将基因组DNA 提取后，扩增其16S rDNA 并进行测序，分别得到片段长度为1394 bp 和1449 bp 的序列。经NCBI BLAST 软件搜索其在GenBank 中的同源性序列，结果表明，QM5 的16S rDNA 序列与Bacillus velezensis的同源性为99 %，QM12 的16S rDNA 序列与Bacillus licheniformis的同源性为100%。基于搜索的同源性序列，利用MEGA X 软件的Neighbor-Joining 功能构建系统发育树，结果见图5。QM5 与Bacillus velezensis聚为一簇，相似性高达99%（图5A），QM12 与Bacillus licheniformis聚为一簇，相似度高达100 %（图5B）。Bacillus velezensis的基因与Bacillus amyloliquefaciens的基因相似度很高，曾被归类同一种微生物[28]，可能是VITEK 2COMPACT 全自动微生物鉴定系统将QM5 鉴定为Bacillus amyloliquefaciens的原因。最新的研究表明Bacillus velezensis与Bacillus amyloliquefaciens的ANI 和dDDH 值低于种水平的阈值，应该保持各自的命名[29-30]。因此，结合VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统的鉴定及16S rDNA 测序结果，QM5 鉴定为Bacillus velezensis，QM12 鉴定为Bacillus licheniformis。

表3 QM5和QM12 在BCL鉴定卡上的生化反应结果

图5 菌株QM5和QM12的系统发育树

3 结论

本研究通过稀释平板混菌法从泸州老窖高温大曲中分离纯化得到13 株蛋白酶高产菌株QM1—QM13，经形态学鉴定，均为革兰氏阳性芽孢杆菌。将其接种到发酵培养基中，37 ℃、180 r/min 条件下培养24 h，离心获得粗酶液，由琼脂糖-纤维蛋白原平板测定纤溶酶活性，获得2 株纤溶酶活力较高的菌株QM5 和QM12，纤溶酶活力分别为3711.48 IU/mL±418.93 IU/mL 和4270.83 IU/mL±563.52 IU/mL，与已有的研究结果相比，其属于纤溶酶高产菌株。结合VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统、16S rDNA 全序列测定及系统发育树分析结果，QM5 为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），QM12 为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。