宣酒酿造微生态系统中高产中性蛋白酶功能菌株的筛选与鉴定

朱国星，田 源，司冠儒，梅 婕，张卫卫，张温清，高传强

（1.江南小窖酿造工艺研究所，安徽宣城 242000；2.安徽宣酒集团股份有限公司科研中心，安徽宣城 242000）

芝麻香型白酒是中国白酒十二大香型之一，芝麻香型白酒香气的典型特征是具有幽雅的类似于烘焙芝麻的焦糊香气[1]。在工艺上，芝麻香型白酒生产是在酱香型白酒生产工艺的基础上，融合了清香型和浓香型白酒生产工艺衍生而来。芝麻香用曲的构成十分复杂，由5 个种类的曲所构成：功能麸曲包括河内白曲，细菌曲，酵母曲；包包曲；高温大曲，称之“大麸结合”[2]。

白酒酿造原料中蛋白质的分解需要蛋白酶，细菌曲是主要蛋白酶的来源之一，因此细菌曲中蛋白酶对于白酒酿造有十分重要的作用[3-4]。蛋白酶的主要作用有3 种：一是有效地水解包裹发酵原料富含蛋白质的壳，提高微生物可利用的糖含量，进而提高产酒率；二是蛋白酶降解增加了可以被酵母利用的氨基酸，促进酵母生长代谢，节约其他用于生长的能源；三是蛋白酶降解得到的氨基酸可以参与美拉德反应，产生吡嗪类、呋喃类等香味物质，也可以被不同微生物及酶的代谢作用产生多种香味物质。白酒酿造微生物中，芽孢杆菌属是一类重要的产蛋白酶菌属，且具有良好的环境耐受性和乙醇耐受性等优质特征[5-6]。

本研究以宣酒高温大曲为筛选材料，通过测量平板透明圈和检测中性蛋白酶活力，筛选及鉴定了宣酒酿造微生态系统中高产中性蛋白酶的功能菌株，并应用于细菌麸曲的生产。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

菌株分离材料：宣酒高温大曲。

试剂与耗材：细菌基因组DNA 快速提取试剂盒，上海捷瑞生物公司。福林酚试剂、碳酸钠、三氯乙酸、盐酸、干酪素、葡萄糖、琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、酪氨酸等均为分析纯，购于国药试剂有限公司。

仪器设备：紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；超纯水仪（A2S-10-CE），美国艾科浦国际有限公司；水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；恒温摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司；冰箱，海尔集团。

1.2 培养基

LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g；用5 mol/L 氢氧化钠调pH 值至7.0，用去离子水定容至1 L，115 ℃蒸汽灭菌20 min。

脱脂牛奶培养基：A 液：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，pH 值7.0。B 液：脱脂纯牛奶。A 液和B 液单独灭菌，115 ℃灭菌20 min，9∶1混合均匀后使用。

以上两种固体培养基配制方法：在液体培养基中添加2%的琼脂粉。

发酵培养基：葡萄糖30 g，酵母浸膏20 g，磷酸氢二钠4 g，磷酸氢二钾0.3 g，用5 mol/L 氢氧化钠调pH 值至7.0，用去离子水定容至1 L，在115 ℃蒸汽灭菌20 min。

麸曲培养基：麸皮650 g，豆粕粉300 g，稻壳50 g，氢氧化钠4 g，加水600 mL，115 ℃灭菌25 min。

1.3 试验方法

1.3.1 高产中性蛋白酶功能菌株的分离与纯化

称取5 g 粉碎后的高温大曲，加入装有50 mL无菌水的250 mL三角瓶中，在三角瓶中加入一定量灭菌的玻璃珠，于37 ℃培养箱中振荡培养30 min。将样品悬浮液于80 ℃水浴10 min，杀死非芽孢杆菌营养细胞，得到芽孢杆菌悬浮液。吸取1 mL 上述悬浮液于装有50 mL 营养肉汤培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min 培养24 h。将培养好的菌液梯度稀释6次至10-6，每个梯度菌液吸取100 μL涂布于固体营养肉汤培养基平板，37 ℃培养24 h。挑选不规则，菌落边缘不整齐且表面粗糙的干燥型单菌落进行纯化培养。

1.3.2 高产中性蛋白酶功能菌株的初筛

将单菌落先接种到营养肉汤培养基，37 ℃、200 r/min 培养24 h，之后在脱脂牛奶平板划线，37 ℃培养24 h。根据菌株在脱脂牛奶培养基平板上产生的透明圈直径和菌落直径比值大小，初步评估菌株产蛋白酶能力的高低。

1.3.3 高产中性蛋白酶功能菌株的复筛

挑选脱脂牛奶培养基平板上透明圈直径和菌落直径比值较大的菌株接种于装有10 mL LB 培养基的50 mL 三角瓶中，37℃、200 r/min 培养24 h。将培养的菌液作为种子液以2 %的接种量接种到装有50 mL 发酵培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min 培养24 h。取1 g 发酵液于50 mL 试管中，加入磷酸盐缓冲液定容到20 mL，稀释20 倍，中性蛋白酶活力的测定按照GB/T 23527—2009 所述方法操作[7]。

1.4 高产中性蛋白酶功能菌株麸曲固态发酵

将菌株接种至装有10 mL发酵培养基的50 mL摇瓶中，37 ℃、200 r/min 培养24 h。将上述培养液作为种子液以10%的接种量接入装有70 g 麸皮培养基的500 mL 摇瓶中，37 ℃培养48 h。取一定量的培养物称重并记录，105 ℃烘干至恒重，然后称重，计算其含水量。称取5 g左右的固态培养物，加入200 mL的磷酸盐缓冲液，稀释20倍，过滤之后用福林酚法测定蛋白酶活力。

1.5 产物分析

培养物中酸性蛋白酶测定按GB/T 28715—2012所述进行[7]。

1.6 菌株鉴定

利用细菌DNA 提取试剂盒提取菌株染色体DNA，然后送上海生物工程有限公司进行16S rDNA 测序，得到测序结果并进行NCBI 比对分析，确定菌株的种属类别。16S rDNA 正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC TT-3’。

2 结果与讨论

2.1 高产中性蛋白酶功能菌株的初筛

芽孢杆菌作为产蛋白酶的代表性菌种，且在高温条件下产生孢子抵御高温胁迫，所以选择高温大曲作为筛选高产蛋白酶功能菌株的材料。高温大曲中具有典型特征的单菌落接种到脱脂牛奶平板上，利用透明圈直径和菌落直径比值(圈径比)为指标进行初筛，共筛选能够在初筛脱脂牛奶培养基平板上生长并产生透明圈的菌株339株，其中圈径比小于3的有141株，介于3～5.5的有192株，大于或等于5.5的有6株，选择圈径比大于5.5的菌株进行复筛，6株菌分别命名为XJXJ-001、XJXJ-002、XJXJ-003、XJXJ-004、XJXJ-005和XJXJ-006（表1）。

表1 高温大曲高产中性蛋白酶菌株初筛

2.2 高产中性蛋白酶功能菌株的复筛

为了验证初筛得到的6 株菌的产蛋白酶能力，将各个菌株进行发酵培养基发酵实验。结果如表2所示，其中菌株XJXJ-002 的蛋白酶活力达到115.30 U/g，为所有菌株中最高值，该结果表明，菌株XJXJ-002 产蛋白酶能力在6 株菌中最强。但菌株XJXJ-002 的细胞浓度比其他5 株菌低，但蛋白酶活力最高，可能原因是该菌株利用氮源主要用于生产更多的蛋白酶，而不是用于自身生长繁殖。

表2 菌株摇瓶发酵产中性蛋白酶

表3 菌株摇瓶发酵产中性蛋白酶

用发酵培养基替换种子培养基可能会提高菌株蛋白酶活力，因此将菌株接种到发酵培养基这一方式进行后续发酵实验。结果如表3 所示，菌株XJXJ-001，XJXJ-002 XJXJ-003，XJXJ-004，XJXJ-005 和XJXJ-006 蛋白酶活力都比更换种子培养基之前有提高，分别提高29.07%、95.91%、166.14%、140.38 %、30.91 %和17.74 %。因为芽孢杆菌生产蛋白酶是和生长偶联的，所以种子培养基被替换为碳氮源丰富的发酵培养基，有利于菌株生产蛋白酶。由表2 和表3 结果可以得出：（1）在6 株复筛的菌株中，XJXJ-002 产蛋白酶能力最强；（2）更换种子培养基会影响各菌株蛋白酶的产量。

2.3 中性蛋白酶功能菌株麸曲固态发酵实验

将复筛的6 株菌株分别接种到麸曲固态培养基，进行发酵实验。结果见表4，固态麸曲发酵条件下蛋白酶产量最高的是XJXJ-002，为256.72 U/g。且测试的6 株菌固态发酵蛋白酶活力均比液态发酵条件下有所提高，表明不同的培养基成分能够影响菌株产蛋白酶能力。

表5 XJXJ-002的16S rDNA鉴定

XJXJ-002 固态麸曲的颜色呈微黄色、有光泽；香味有浓郁的焦香味、略有氨味；形态上比较疏松柔软。从感官角度XJXJ-002 固态麸曲达到优质细菌曲的标准。且理化指标正常：细菌总数9.13×108CFU/g，酸度2.58 mmol/100 g 曲。理化指标上，XJXJ-002 固态麸曲也达到优质细菌曲的标准。所以XJXJ-002 菌株应用于固态麸曲生产中具有非常大潜力，并可进一步促进芝麻香型白酒品质的提升。

2.4 菌株16S rDNA鉴定

为了以上筛选的6 株菌进行鉴定，分别提取6株菌株的染色体DNA，送上海生工进行16S rDNA测序，之后将结果进行NCBI 比对分析。菌株XJXJ-002 的比对结果如表5 所示，菌株XJXJ-002SD48 与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）相似性最高。XJXJ-001、XJXJ-003、XJXJ-004、XJXJ-005 和XJXJ-006 菌株的鉴定结果分别为Bacillus velezensis，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

3 结论

本研究以中性蛋白酶活力为筛选指标，以宣酒高温大曲为目标分离材料，选育了宣酒酿造微生态系统中6 株高产蛋白酶功能菌株，通过分子生物学手段进行了种属鉴定，并应用于固态麸曲的生产。解淀粉芽孢杆菌XJXJ-002 固态麸曲中蛋白酶活力达256.72 U/g，其他参数也达到优质麸曲标准。解淀粉芽孢杆菌XJXJ-002 在芝麻香型白酒细菌麸曲的生产，以及芝麻香白酒品质的提升方面具有非常大的潜力。