肝窦内皮细胞在肝窦阻塞综合征中的作用：聚焦潜在的治疗方法

傅泽宇，刘向前，任虹

（1华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，武汉 430022；2华中科技大学同济医学院基础医学院组织学与胚胎学系，武汉 430030；3 华中科技大学同济医学院附属协和医院生物样本中心，武汉 430022）

肝窦阻塞综合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome， HSOS）是一种潜在威胁生命且死亡率达80%的疾病[1]。HSOS的病因大多与造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation， HSCT)[2]、传 统放化疗[3]、服用含有吡咯里西啶生物碱（pyrrolizi- dine alkaloids， PAs）的中草药如土三七等有关[4]。HSOS主要是由于肝窦内皮细胞（hepatic sinusoidal endothelial cell， LSEC）的损伤所导致，但确切的发病机制还不太清楚。目前认为主要与氧化应激、炎症反应、凝血因素等有关[5-7]，这些因素可导致肝窦阻塞，引起门脉高压，以及一系列临床症状，最终进展为肝肾功能不全、多器官衰竭和死亡[8]。目前美国FDA批准用于HSOS临床治疗的药物只有去纤苷（defibrotide， DF）。DF价格昂贵并具有出血风险，因此，开发新的价格便宜、副作用更小的药物成为迫切需求[9]。

LSEC是肝脏内高度特化的内皮细胞，具有细胞间连接不紧密、细胞上有窗孔无隔膜、细胞下基膜缺乏等特征，在肝窦腔血液和肝实质之间承担物质交换、血流调控、内吞作用和免疫调节等功能[10]。目前认为LSEC的损伤是HSOS发生发展的第一步，并参与后续的病理过程[11]。理解LSEC在HSOS发病过程中的作用，将有利于以LSEC为靶点针对性地研发新的防治药物。本文除综述LSEC的结构、功能及其在HSOS发病机制中的作用外，还介绍目前临床前研究中对HSOS有潜在防治效果的药物、治疗方式，归纳其机制和动物模型疗效，希望为将来HSOS防治相关的临床研究提供参考，并将有潜力的药物进一步推向临床。

1 肝窦内皮细胞（LSEC）的结构和功能

1.1 LSEC的解剖特点和选择性屏障功能

肝脏具有双重血供，20%～25%血流来自充分氧合的肝动脉，75%～80%来自携带胃肠道营养成分的门静脉。血流经过肝板间由LSEC排列成的窦道（肝脏的毛细血管床）流入肝小叶中央静脉、小叶下静脉、肝静脉，最终汇入腔静脉[10，12]。LSEC虽然只占肝脏总体积的3%，但却是最主要的肝脏非实质细胞[13-15]。LSEC位于肝脏微循环和肝实质的交界面，在远离窦腔的一面通过Disse间隙与肝细胞交流，而在窦腔面直接接触循环中的血液细胞和多种物质[16]。LSEC是一种没有基膜和隔膜的单层扁平细胞，胞质稀薄处含大量窗孔，并成簇排列成筛板，覆盖内皮表面6%～8%的面积，构成一道选择性透过屏障，不仅可让肝实质与血液自由交换营养物质和氧气，还能使有害物质，如代谢产物和细菌被肝细胞或肝星状细胞（hepatic stellate cell， HSC）摄取处理[10，12，13，17，18]。根据物种、年龄和观察技术的不同，贯穿胞质的窗孔直径范围在50～200nm[10，13，19，20]。窗孔的排布模式受所处肝叶的解剖位置影响：越靠近小叶中央区域，每个筛板上的窗孔数量越多直径越小，而越靠近门脉周围区则窗孔数量越少直径越大。这种排布特征是由肝窦内氧浓度梯度的差异所造成[13，21]。LSEC的选择性渗透功能部分由窗孔直径决定，直径小于窗孔的小颗粒和气体能自由通过窗孔，而较大的颗粒则可能通过其变形能力通过（如炎症细胞）或被代谢分解成小于窗孔直径的颗粒（如脂质转运）通过，而其余的则被截留在窦腔内[10，13，22]。窗孔并非是静态的结构[23]，其孔径受多种因素调节，如血压、激素、药物、毒性物质、胞外基质、疾病、衰老和暴露于环境污染物砷等[10]。而窗孔的多孔性（窗孔面积与内皮细胞总面积的比值）则受酒精、饮食营养成分、禁食状态或限制热量摄入等的影响[14]。这种动态改变与细胞骨架成分肌动蛋白微丝、微管等结构的活动有关[24，25]。除了窗孔的动态变化受到调节外，窗孔的存在也需要旁分泌和自分泌两种方式来维持[26]。邻近的肝细胞和肝星状细胞旁分泌的血管内皮细胞因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）可以刺激LSEC细胞内一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）诱导一氧化氮（nitric oxide， NO）的自分泌，通过NO依赖途径以及NO非依赖途径来维持LSEC的正常表型[21，27，28]。另有研究表明，纤维连接蛋白可能也是窗孔维持所必需的信号分子[29]。肝窦内皮细胞不像肺、肾、脾等其他器官中的内皮细胞具有隔膜，这可能与其质膜囊泡相关蛋白（plasmalemma vesicle-associated protein，PLVAP or pv1）的低表达有关[19，30-32]。由PLVAP基因编码的PLVAP是隔膜的关键组成部分，通常以放射状纤维排布形成同源二聚体的形式锚定在细胞膜上，是隔膜通透性功能的重要承担者[30，33，34]。虽然包含PLVAP的隔膜并不存在于成年个体的LSEC中，但会在胚胎发育时期的LSEC中短暂出现，之后又随着发育消失[20，35，36]，表明PLVAP在LSEC发育过程中可能承担着一些重要功能，如调控胎儿期巨噬细胞到组织的定植过程[37]。

肝窦内皮窗孔还参与淋巴液的生成。各种血浆成分通过LSEC 窗孔过滤进入Disse间隙，形成淋巴液，淋巴液汇入门管区的小淋巴管道离开肝脏。人体内每天近一半的淋巴液通过此方式产生[38-40]。窗孔给跨内皮的淋巴细胞-肝细胞相互作用（transendothelial hepatocyte-lymphocyte interaction， TEHLI）提供通道。淋巴细胞的胞质突起（伪足）穿过窗孔与肝细胞的微绒毛发生直接接触，这一过程介导幼稚T淋巴细胞的激活，对免疫耐受的发育具有重要意义[41]。

LSEC的屏障功能与其结构和解剖定位密不可分，互相影响。对LSEC结构的研究有助于理解其在机体生理和病理过程中所发挥的作用。目前对LSEC屏障功能的了解还很有限，有关细胞骨架成分对窗口调控的机制也有待深入，进一步研究隔膜以及PLVAP在肝窦内皮窗孔发育过程中的作用可能是今后的一个研究方向。

1.2 LSEC的血流调节作用

进入肝脏的血液压力在肝窦内被平衡。虽然由于消化作用使肝脏血流出现昼夜节律性变化，但正常个体肝静脉血压波动却一直维持在4mmHg以内，这源于肝脏微循环系统对血管的调控作用[13]。LSEC是肝窦血流的重要调节器，具有感知血压和剪切力的变化、维持较低的门静脉血压、避免微循环失调的能力，与肝脏内其他几种细胞共同保证肝脏微循环血流的稳态[12，42，43]。肝循环内的剪切应力被认为是主要的血流调节的驱动者，它可以通过刺激内皮细胞释放多种血管活性物质调控血管紧张性[44，45]。正常条件下，LSEC可以生成两种强力的血管活性因子NO和内皮素1（Endothelin-1， ET-1），分别具有舒张血管和收缩血管的能力[46，47]。通过调控这两种活性物质调节血管剪切力，从而降低血压。这一过程由内皮特异性转录因子和抗血管生成因子KLF2 (Kruppel-like factor 2 )的激活介导。在血流剪切力的作用下，KLF2激活内皮细胞内eNOS ，诱导NO的生成；并且KLF2还诱导ET-1的下调[48-51]。另外，LSEC还能分泌一氧化碳（carbon monoxide， CO）以及环氧合酶（cyclooxygenase， COX）途径代谢物，如血栓素A2（thromboxane A2， TXA2）和前列环素，调控血流[52]。HSC是可收缩的细胞，包绕肝窦外表面，并表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）[53，54]。LSEC分泌的这些血管活性因子能以旁分泌的方式作用于邻近的HSC，维持静止状态，抑制HSC介导的血管收缩从而间接调控肝窦血流[53，55]。研究显示，LSEC自身能膨大形成入口和出口括约肌调节血流[56]。LSEC可抑制Kupffer细胞的激活，从而抑制Kupffer细胞激活后引起TXA2释放所导致的缩血管作用[57，58]。总之，肝窦血流稳态的调控受多种细胞组分的影响， LSEC在这一细胞生物学信号级联中发挥着重要作用。但迄今为止，部分观点只有体外实验证据并存有争议，有待进一步验证。

1.3 LSEC的内吞作用

肝窦内皮细胞表达大量的内吞清除受体（endocytosis receptor），是内吞能力最强的细胞之一[14，59]，主要通过清除受体（scavenger receptor， SR）、甘露糖受体（mannose receptor， MR）以及Fc gamma受体 IIb2（FcγRIIb2） 经内吞作用来清除可溶性大分子和小颗粒[13，60]。其中SRs介导氧化和乙酰化低密度脂蛋白（oxidized and acetylated low-density lipoprotein， oxLDL and acLDL）、晚期糖基化终产物（advanced glycation end products， AGEs）、废弃产物（透明质酸、肝素、硫酸软骨素、前胶原蛋白氮端前肽）等物质的摄取和降解[10，13，60]。SRs中SR-H的两种同源受体stabilin-1 和 stabilin-2被认为是发挥这一功能的主要受体[10，60]。目前认为stabilin-1 和 stabilin-2有部分功能重叠，其中一个基因型缺乏并不会产生明显的病理改变。与stabilin-2相比，在维持部分阴离子颗粒的清除功能方面，stabilin-1 显得更不可或缺。但不同程度stabilin基因的缺失会引起转录组学的变化，使SR相关的基因下调。当stabilin-1 和 stabilin-2同时缺失时还会造成个体过早死亡以及肾小球纤维化，表明stabilin-1 和 stabilin-2不仅在维持肝脏清除血液有害物质过程中发挥作用，同时还能保证远端器官组织的稳态[61-63]。MRs是一种C型凝集素，具有维持免疫和糖蛋白稳态的功能。虽然多种类型的细胞表达MRs，但在肝脏中MRs主要分布于LSEC上。MRs可以有效清除循环中的多糖蛋白和微生物多糖物质，包括胶原蛋白α链、黄体生成素（Luteinizing hormone， LH）、组织纤溶酶原激活物以及溶酶体酶。这种MRs介导的对溶酶体酶的招募有助于维持LSEC较强的溶酶体降解能力[10，13，64-66]。另外，肝脏中MRs的表达也受炎症刺激和细胞因子调控。IL-1可上调MRs表达从而增强LSEC的内吞作用，而IL-10则会削弱MRs的活性[67，68]。作为肝脏内唯一的Fc γ受体，FcγIIb2介导循环小分子免疫复合体和部分IgG免疫复合体的清除[10，69，70]。这些受体除了参与LSEC的内吞清除功能，还与LSEC的免疫调节功能有关。

1.4 LSEC的免疫调控功能

作为肝脏免疫系统的守门员，LSEC还参与固有免疫和适应性免疫应答，这均依赖于其表达的多种受体。其中部分固有免疫应答功能由内吞清除作用介导[14]。LSEC表达的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）除了SR外还包括Toll样受体（Toll-like receptors， TLRs）家族，使LSEC不仅可识别并清除细菌及其产物，还能分泌炎症介质和调节胞外基质（extracellular matrix， ECM）[14，71]。LSEC对体内的TLRs配体有很强的感应能力，极低浓度的脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）（＜100pg/ml）就可促使LSEC分泌促炎介质IL-6[72，73]。LSEC对TLR1～9中的1、2、3、4、6、8、9配体具有不同的免疫反应，对器官特异性稳态有重要的促进作用[74]。作为一种器官常驻抗原呈递细胞（antigen presenting cell， APC），LSEC具有比部分专职APC，如树突状细胞（dendritic cell， DC））还要强的抗原摄取能力[72，75，76]。LSEC能通过其内吞受体参与病毒的清除，在一项腺病毒清除的小鼠模型中，几乎所有注入体内的腺病毒都能在短时间内被LSEC清除，表明LSEC具有迅速高效的血源性病毒清除能力[14，77]。几种C型凝集素受体家族成员也能直接摄取病毒，如DCSIGN和LSIGN能与埃博拉病毒和人类免疫缺陷病毒以及冠状病毒发生相互作用[78，79]，LSECTIN参与严重急性呼吸综合征冠状病毒和丙型肝炎病毒的摄取[80，81]。由于LSEC持续暴露于来自胃肠道的细菌产物，如果激活正常的免疫应答就会使肝脏免疫系统长期处于激活状态，产生有害效应[82]。因此，LSEC在这一过程中可以诱导对LPS耐受并减少白细胞黏附，这些可能与核因子κB的核转位减少有关[83]。此外，在适应性免疫应答中，LSEC可以通过MR摄取处理可溶性内源性抗原以及口服抗原，并通过组织相容性复合体（major histocompatibility complex， MHC）Ⅰ类分子交叉呈递给CD8+T细胞，促使CD8+T细胞产生耐受[84-86]。这种免疫耐受由LSEC上的共刺激分子程序性死亡配体1（Programmed death ligand 1， PD-L1）上调所介导[87]。LSEC所介导的这些免疫耐受作用使免疫系统不会对正常无害的抗原作出过激的免疫反应，从而阻止异常的炎症状态和组织损伤。但在面对有害抗原时，LSEC又能使这种耐受作用转变为激活免疫反应的作用。在高浓度的抗原刺激下，可以诱导CD8+T细胞的这种致耐受作用转换为诱导效应T细胞的分化作用，从而清除抗原[14，88]。在IL-6转导信号通路存在的情况下，LSEC能诱导CD8+T细胞迅速分化为效应T细胞，并且使其进一步对炎症因子作出应答，引发增强和持续的效应功能[89]。

LSEC也表达MHCⅡ类分子，向CD4+T细胞呈递抗原。虽然细胞上共刺激分子水平不高，但能驱使CD4+T细胞分化为调节性T细胞（regulatory T cell， Treg）而非辅助T细胞（helper T cell， Th）[90，91]。这种LSEC诱导的Treg细胞在诱导免疫耐受方面具有重要作用[92]。LSEC同样也能诱导部分CD4+T细胞（CD4+胸腺移出细胞）对自身和消化道源性的抗原产生免疫耐受[93]，以及诱导促炎细胞Th1表达抗炎因子IL-10，从而调控肝脏内炎症免疫反应[94]。LSEC还能调控浸润的炎症CD4+T细胞的活性，在IL-10和PD-1作用下抑制CD4+T细胞（Th1和Th17）分泌炎症因子IFN-γ或IL-17削弱其效应功能[95]。LSEC还能通过白细胞招募作用，调控免疫功能。这种对白细胞的招募一般是通过细胞间黏附分子，如血管黏附蛋白-1（vascular adhesion protein-1， VAP-1） 和stabilin-1介导[96]。此外，肝窦血压低和剪切力弱的解剖特点也使其不同于传统血管床选择素依赖的募集黏附过程， LSEC表达的非典型黏附分子在这一过程中发挥重要作用[14，42]。LSEC可以通过激活髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）依赖的信号通路调控ECM沉积和通过肝内趋化因子浓度梯度来招募和留滞Kupffer细胞和淋巴细胞，从而调控免疫细胞在肝脏的分布[97]。总之，在PRR的表达和对免疫细胞独特的诱导调控作用下，LSEC在维护肝脏固有和适应免疫应答的稳态中发挥了关键作用。

2 肝窦内皮细胞和肝窦阻塞综合征

2.1 HSOS的诊断

HSOS又称肝小静脉堵塞病（veno-occlusive disease， VOD），是一种以造血干细胞移植调理疗法、常规放疗和化疗，以及使用含有PAs的食物或药材等事件为病因的威胁生命的临床疾病[4，98，99]。不同的致病因素会不同程度地造成LSEC的激活和损伤，引起LSEC脱落、窦道堵塞、缺血坏死、炎症和纤维化等一系列病理改变甚至窦后性门脉高压[8，99，100]。黄疸、腹水、肝区疼痛、体液潴留等临床表现是目前诊断该病的重要依据（表1）[100-102]。相比此前的诊断标准，虽然欧洲血液和骨髓移植学会（European Society for Blood and Marrow Transplantation， EBMT）和南京诊断标准加入了影像学技术（超声、 CT、 MRI）辅助诊断，但鉴于没有更具特异性的方法，因此肝组织活检 (病理学检查) 仍然是诊断的金标准[101-104]。研究表明：内皮激活、应激指数（Endothelial Activation and Stress Index， EASIX）和透明质酸等生物标志物都能有效评估患者罹患HSOS的风险，为HSOS早 期防治提供很好的指导作用[105，106]。

表1 HSOS的诊断标准[100-102]Tab.1 Diagnostic criteria for VOD/HSOS

2.2 LSEC 在HSOS病理机制中的作用

Deleve L等人在大鼠模型上复现了HSOS的病理特征[107]，并进行了一系列的相关机制研究，显示疾病发生发展基本过程如下： LSEC因多种因素受损并激活，形态变为圆盘状，窗孔破坏，细胞间缝隙变大，红细胞穿过缝隙进入Disse间隙，并使LSEC剥落。脱落的LSEC堵塞窦腔，肝内淤血。由于窦道堵塞，使得组织缺血缺氧，肝细胞坏死。坏死的组织释放多种因子，引起炎症浸润，进一步加重组织损伤，甚至可致纤维化[7，108]。虽然大量研究表明LSEC在HSOS病理过程中起着重要作用，但确切的机制仍未阐明，以下是目前提出的可能机制。

2.2.1 LSEC的激活与损伤

LSEC的激活与损伤被认为是整个HSOS发病过程的第一步，不同致病因素以不同的作用方式介导了LSEC的损伤[109]。HSCT相关的HSOS，除了调理治疗对LSEC造成损伤外，移植过程本身就可通过同种异体反应导致LSEC的损伤[110]。体外实验中，自体HSCT (auto-HSCT) 的内皮细胞损伤标志物在14 d时就达到最大峰值，而在同种异体HSCT（allo-HSCT）中14 d后持续上涨至21 d形成峰值[111]。说明allo-HSCT中所致的内皮细胞损伤更持久。多中心临床实验分析也证明allo-HSCT相关的HSOS（8%）发病率比auto-HSCT（3%）更高[112]。放射治疗的电离辐射也能诱导LSEC凋亡和破坏脱落[113]。多种细胞毒性化疗药物或其代谢激活后的有毒产物均可损伤LSEC[3，6，114-117]。奥沙利铂（Oxaliplatin）诱导的小鼠模型中，奥沙利铂介导了LSEC的老化，导致内皮细胞的破坏[3]。这种损伤在临床上也得到证实[118]。此外，Deleve等人证实：与肝细胞相比，化疗药物咪唑硫嘌呤、环磷酰胺、达卡巴嗪更易损伤LSEC[114-116]。摄入含PAs的中草药或被其污染的食物后，PAs在体内的代谢物脱氢吡咯生物碱（DHPAs）可造成LSEC损伤[119，120]。

关于LSEC损伤的具体过程，一项野百合碱（monocrotaline， MCT）诱导的大鼠HSOS模型实验做了详细阐述[11]：PAs被摄入体内后，经胃肠道吸收和门静脉系统转运至肝脏；在细胞色素P450单氧酶（cytochrome P450 monooxygenases， CYPs），尤其是CYP3A4的催化作用下，PAs被代谢激活为DHPAs；DHPAs可以与细胞的DNA、蛋白质、谷胱甘肽（glutathione， GSH）等物质发生反应，尤其是与细胞内的蛋白质形成PPAs，被认为是造成细胞损伤的主要原因[109，119，120]。GSH是一种细胞内抗氧化应激的物质，在肝脏的解毒功能中具有重要作用[121]。正常情况下除了与细胞蛋白结合形成PPAs，DHPAs也能在谷胱甘肽的作用下形成无毒的吡咯-谷胱甘肽复合物，是肝脏中重要的解毒方式[122，123]。与肝细胞相比，LSEC中的GSH基础水平较低，PAs代谢激活方式可能不同[114，123]，使LSEC成为肝脏中最先受损的细胞。由于肝腺泡3区（中央静脉周围区）相比其他区域的P450表达水平更高而GSH水平更低，因此损伤一般从该区开始[124]。这些毒性PPAs可以与LSEC内的F肌动蛋白共价结合，导致细胞内的F肌动蛋白解聚，进而诱导细胞内基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）的表达和活性增加，以及细胞变为圆盘状。而上调的MMPs可降解细胞与Disse间隙间的ECM，降低内皮与Disse间隙连接的牢固度，促使LSEC脱落[11，117，119]。在HSOS中， NO对肝脏及LSEC具有保护作用。肝脏内NO主要来源于LSEC，但MCT可导致NO生成减少，从而诱导MMP活性上调，加剧内皮破坏，加重HSOS[125，126]。GSH则可抑制MMP活性，对肝窦内皮完整性具有保护作用[127]。大量研究显示：GSH水平的降低、NO生成的减少和MMP活性的上调，是导致LSEC损伤脱落并引发HSOS的重要因素。

2.2.2 LSEC在凝血系统激活中的作用

血液成分进入内皮周围Disse间隙，可引起肝窦狭窄和血管阻力升高，导致血流变缓；内皮的损害会暴露内皮下组织，导致组织因子（tissue factor， TF）释放，引发血小板聚集和凝血级联激活；损伤组织释放多种细胞因子，可介导损伤和参与凝血；脱落的内皮会阻塞肝窦，导致血流瘀滞[100，117，128，129]；这些因素从理论上讲均可导致肝窦内的血栓形成[19，130]。但是多年来这一理论并没有获得足够证据的支持，临床也未将HSOS定义为血栓性疾病[108，117]。值得注意的是，在HSOS的发生发展过程中存在肝脏血管系统的凝血-纤溶失衡，表现出高凝、低纤溶状态[131，132]；而且近期还有研究发现HSOS可导致血栓形成[133-135]。LSEC的损伤会导致凝血途径相关因子的上调，血小板聚集，甚至肝窦内血栓形成[129]。在HSOS患者体内，已检测到内皮损伤标志物（如血栓调节蛋白和P选择素）与凝血途径激活标志物（如凝血酶原片段1+2和凝血酶-抗凝血酶复合物）的升高，抗凝血物质（如蛋白C、蛋白S和抗凝血酶）的下降，纤溶作用抑制剂（如PAI-1）的增加，以及血管性血友病因子（von Willebrand Factor， vWF）、TF和凝血级联下游信号分子（如VIII因子、X因子及其激活态受体）的上调，从而增加血小板黏附和凝血激活的几率[3，7，100，108，136]。除了从血液发现凝血系统激活外，使用基因微阵列技术也同样检测到凝血系统相关基因（如vWF）的上调[137，138]。无论凝血相关物质的变化是原发性还是继发性，均共同促成了凝血-纤溶平衡的失调。近年来，更多HSOS机制研究集中在血小板聚集的作用，由于LSEC的破坏脱落，血小板聚集在Disse间隙，即外渗性血小板聚集（extravasated platelet aggregation， EPA）[133，139]。这些血小板可被肝细胞吞噬并发生相互作用，但具体病理改变及其作用机制尚不清楚。使用磷酸二酯酶III抑制剂抗LSEC损伤和抗EPA能减轻HSOS，说明血小板聚集可能具有重要作用[139，140]。临床上采用抗凝治疗，如肝素、华法林等取得一定的治疗效果，从侧面反映了高凝状态在疾病机制中的作用[101，137]。虽然目前凝血级联的激活在HSOS中的具体作用还不清楚，但LSEC的损伤促进了其激活，因此，同时具有保护内皮细胞和抗凝性质的药物可能会对患者更有疗效[19]。

2.2.3 LSEC在炎症反应中的作用。

HSOS中有肝脏炎症细胞浸润，炎症反应早期可能与LSEC失去正常表型后所表达黏附分子的变化有关，晚期可能由于组织广泛损伤而导致炎症浸润[19，141]。放射、化疗和调理治疗药物除损伤内皮细胞外还会对其表型产生直接影响，上调其黏附分子ICAM-1及VCAM-1[2]。而损伤组织周围细胞释放的多种细胞因子又会诱导LSEC的炎症通路NF-κB的激活和多种黏附分子（如ICAM-1， E-selectin）和趋化因子（如IL-8）的表达上调，通过招募白细胞，诱导其浸润和血管渗出，加重组织炎症损伤[14，19]。动物实验表明：HSOS中趋化因子CXCL1（相当于人体内的IL-8）血浆水平上升、CXCL1及CXCL2表达上调、肝脏中MPO活性增强、CD11b和Gr-1阳性免疫细胞计数增加，证实疾病发生过程中白细胞的招募和白细胞浸润[3，142，143]。研究还发现：经典炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达增加[3，141，142，144，145]。动物模型和临床实验微阵列技术分析均发现IL-6和STAT3的表达上调，表明IL-6/JAK/STAT3通路可能参与了HSOS发生发展[3，138]。HSOS中经典炎症信号通路NF-κB的激活，可能与其上游TLRs或热休克蛋白60（heat shock protein 60， HSP60）的上调对其激活有关[141-143，145]。大量研究显示：炎症反应参与HSOS的病理过程，LSEC的组织损伤导致局部炎症反应，而局部炎症反应加剧组织损伤，形成一个正反馈环，使HSOS不断恶化。

2.2.4 LSEC在氧化应激中的作用

LSEC对氧化应激非常敏感，前文所提及的多种病因对LSEC的损伤绝大部分都是由氧化应激介导的[146]。除PAs外，奥沙利铂、咪唑硫嘌呤、达卡巴嗪等化疗药物同样可以造成LSEC内GSH的含量减少[6，114，116]。氧化应激被认为是这类肝毒性物质造成LSEC损伤中细胞缝隙形成的直接原因[146]。除氧化应激对LSEC的直接损伤外，氧化应激损伤的组织也会释放大量自由基（如超氧化物）造成LSEC的损伤[19]。在HSOS动物模型中能检测到大量活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）的产生，ROS可以攻击多种生物分子（如蛋白质、DNA或脂质）从而生成丙二醛（malondialdehyde， MDA）和4-羟基壬烯酸（4-Hydroxynonenal， HNE）等产物[147]。为了减轻氧化应激损伤，肝脏内两种重要的抗氧化剂GSH和超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase， SOD）被大量消耗，其中GSH被ROS氧化生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）[147]。反应导致肝组织中氧化应激指标ROS、MDA和 4-HNE的升高，而抗氧化剂GSH、SOD及相关酶大量减少[141，142，147，148]。HSOS中的氧化应激损伤可能主要抑制了NRF2抗氧化应激通路，在MCT诱导的HSOS模型中NRF2及其下游的多个基因，包括GCLC、GCLM、TXN1和NQO1等表达下调[141，147]。 而其余与氧化应激相关的基因包括Mt1， HO1和SOD3则表达上调[3]。临床微阵列技术分析也发现氧化应激相关基因上调[138]，氧化还原系统的失衡导致LSEC坏死、组织损伤、脂质过氧化、蛋白降解等系列反应[6]，在HSOS发展中起着重要作用。

2.2.5 LSEC在肝脏纤维化中的作用

HSOS发展后期，部分中央静脉附近区域肝窦纤维化，阻塞加重[108]。HSC介导肝脏纤维化的发生，而LSEC具有维持HSC静止的作用，目前认为这种作用可能与LSEC表达的转录因子锌指E盒结合同源序列 (zinc finger E-box-binding homeobox， Zeb)2的作用相关。LSEC的损伤则削弱了这种保护作用，从而导致纤维化[100，107，149]，其机制可能是作用于调控纤维化的基因TGF-β / Smad，从而引起LSEC表达大量α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和原胶原Ⅰ型。动物模型中发现相应的TGF-β、原胶原Ⅰ型、磷酸化Smad3及其下游基因上调，α-SMA也存在上调趋势[3，144]。LSEC损伤后，正常表型丢失，导致大量ECM产生并沉积在肝窦内，促进纤维化；且LSEC旁分泌脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty acid-binding protein， A-FABP）作用于HSC，通过激活JNK通路促进其生成TGF-β，从而促进纤维化[150，151]。动物模型中发现3种胶原基因表达上调，长期炎症可能导致肝脏内胶原沉积形成纤维化[3]。炎症和纤维化可能相互促进，形成炎症-纤维化正反馈循环介导损伤[144]。在临床实验中发现多种与编码ECM、纤维化形成因子等相关纤维化基因的激活[138]。总之，LSEC的损伤对纤维化抑制作用减弱，其表型的变化引起局部炎症和纤维化，而炎症和纤维化的正反馈机制导致纤维化加重，进一步加重窦道内的阻塞。

综上所述，HSOS的发展是由LSEC的激活损伤、凝血系统的激活、炎症反应、氧化应激和纤维化等机制共同导致的，LSEC在HSOS的发生发展过程中起着重要作用。

3 HSOS的预防和治疗

3.1 目前的预防和治疗药物

3.1.1 预防

临床试用于预防HSOS的药物包括：抗凝血酶、前列腺素E1、己酮可可碱肝素、肝素和熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid， UDCA）和去纤苷（defibrotide， DF）。其中抗凝血酶、前列腺素E1和己酮可可碱已证实没有效果，甚至有严重的副作用[152]。肝素和低分子肝素对预防HSOS的效果尚存争议，而且存在出血的可能，使其应用范围受限[153-155]。研究表明UDCA能调控炎症细胞因子的表达和分泌，起到保护肝脏的作用[100]，但对HSOS的预防作用仍存争议[156-159]。近期一项循证医学研究对14项临床随机对照（randomized controlled trial， RCT）实验分析显示：整体上UDCA能降低HSOS的发病，但证据质量较低[160]。有研究表明UDCA预防给药可以有效降低造血干细胞移植抗宿主的发病率并增加生存率，而且可以降低血清胆红素水平[161]，表明对于造血干细胞移植相关的HSOS患者，使用UDCA可能有益。一项三期开放性RCT已经证明DF对HSOS的预防性作用，该研究纳入28家医院和医学中心的365名病人，证明了DF能有效减少HSOS的发生，而且不良事件的发生率同对照组没有明显差异[162]。DF也被英国血液学标准委员会（British Committee for the Standards in Haematology， BCSH）和英国血液骨髓移植协会(British Society of Blood and Marrow Transplantation， BSBMT)推荐用于造血干细胞移植后的HSOS的预防及治疗[163]。

3.1.2 治疗

高剂量的糖皮质激素治疗造血干细胞移植后HSOS获得了英国指南推荐，并且在多个小样本临床病例分析中发现糖皮质激素单独使用及与DF联用均有一定疗效，但由于存在感染风险，因此应谨慎使用[163-166]。经颈静脉肝内门腔静脉分流术（transjugular intrahepatic portosystemic shunt， TIPS）疗效不一，对病人的预后作用有待进一步研究。肝移植虽然是有效的治疗手段，但应当作为危重HSOS以及其他治疗手段无效的终末手段。而t-PA则因为效果不佳和出血并发症不推荐使用[101，167]。目前被广泛认可的治疗手段之一是对症支持治疗。首先应当注意的是水盐平衡的管理，必要时可使用利尿剂。尽量缓解病人的不适症状，如可能造成病人呼吸困难的大量腹水和胸腔积液，及时通过穿刺和氧疗缓解症状。面对病情进展至肾衰竭和无法控制体液潴留的病人，可采用透析治疗。若病情进一步恶化可转移至重症监护室治疗[100，101，152，168]。对于较为严重的病例，支持治疗难以阻止病情恶化，DF可能是唯一有效的治疗手段。

目前，DF是唯一被FDA批准的且证明能有效治疗HSOS的药物[169]。DF是一种来源于哺乳动物组织的单链脱氧寡核苷酸混合物，临床研究表明其具有抗血栓形成、抗炎、抗缺血、保护内皮细胞和纤溶的作用[170]。上世纪DF就已被发现能用于治疗HSOS[171]，近二十年开展的多项研究逐渐确定DF用于治疗HSOS的有效性。早期开展的多中心随机临床试验，对DF的使用剂量25和40mg/kg/day进行了比较，发现两种剂量在治疗HSOS时，完全缓解率、HSCT术后100天生存率和不良事件的发生率没有明显差异，但考虑25mg/kg/day的不良事件发生率可能会更低，因此该剂量成为了DF治疗的推荐剂量[172]。近年一项多中心临床研究亦显示：该剂量可提高生存率[173]。三期临床实验发现DF对合并多器官衰竭（multiple-organ failure， MOF）的病人疗效和生存率方面都展现出良好结果。HSCT后100 d生存率在DF组和对照组分别为38.2%和25%；100 d完全缓解率分别为25.5%和12.5%；不良事件主要有出血和低血压且发生率与对照组没有明显差异，病人对DF具有较好的耐受性[174]。多中心和临床观察研究也支持DF对危重HSOS的治疗效果[173，175]。另外，近期一项大样本的临床研究发现：DF能明显提高儿童以及早期治疗患者的生存率[176]。虽然DF的治疗效果已经非常明确，但其治疗的机制依然不清楚，需进一步研究。

3.2 未来可期待的疗法

由于有效治疗HSOS药物的匮乏，探寻治疗HSOS的药物成为热点，但大部分只在动物模型上验证有效，仍缺乏临床数据。

3.2.1 儿茶素

儿茶素是一种广泛分布于多种可食用植物（如茶叶、咖啡豆、水果）中具有抗炎、抗氧化、抗血栓形成和逆转内皮细胞功能不全等功能的多酚类物质，属于黄酮类化合物[141]。儿茶素具有多种异构体，其中(-)-表儿茶素（EPI）和(+)-儿茶素较为常见，二者均具有抗炎抗氧化应激等多种功能；目前的研究发现EPI和(+)-儿茶素水合物（catechin hydrate， CAT）在动物模型上对HSOS具有保护作用[131，141]。在体研究发现：CAT (40 mg/kg) 能减轻MCT诱导的HSOS大鼠的LSEC损伤、肝组织损伤以及降低MMP-9的表达，恢复因凝血-纤溶平衡失调所致的凝血功能紊乱；可诱导肝脏中Nrf2抗氧化应激通路上调，减轻氧化应激损伤；MCT诱导的大鼠肝组织GCLC、GCLM、NQO1下调和HO-1上调均可被CAT逆转且相关氧化应激指标明显改善。体外实验发现：CAT处理能增强原代人类LSEC（human hepatic sinusoidal endothelial cell， HHSEC）在MCT处理下的存活率和抗氧化应激能力，其机制可能是通过与Keap1蛋白上的Nrf2结合位点相互作用，从而促使Nrf2的解离和转录激活[131]。

HSOS大鼠模型中，EPI (40mg/kg) 具有类似的作用，包括：改善MCT导致的肝功能损伤、降低内皮损伤和MMP9的表达、恢复升高的氧化应激标志物以及下调的Nrf2下游通路基因表达。分子对接分析发现相互作用位点同样是Keap1蛋白与Nrf2的结合位点，但所参与的氨基酸略有不同。EPI对HSOS的治疗作用在早期（24 h）是由Nrf2通路介导的。在Nrf2敲除小鼠中，EPI对HSOS早期（24 h）无效，但在晚期（48 h）则能观察到这种保护作用；HSOS晚期阶段，EPI的作用是通过阻断IκB/NF-κB系统的激活、减少炎症细胞浸润及炎症介质的释放从而缓解损伤的。而且NF-κB通路是由HSP60蛋白的释放激活的，而EPI也能抑制其从线粒体释放至循环中。因此目前认为EPI可以通过抑制氧化应激和炎症通路的激活从而起到保护作用[141]。目前对EPI的作用机制探究的更清楚，因此EPI可能比CAT更有临床应用前景。另外儿茶素其余异构体是否同样对HSOS具有类似的保护作用也是值得研究的方向。

3.2.2 索拉菲尼和瑞格拉菲尼

索拉菲尼（Sorafenib）和瑞格拉菲尼（Regorafenib）为临床仅有的由美国FDA批准的肝细胞肝癌靶向药物[177]。二者均为口服多重激酶抑制剂，且都能作用于血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR）和 血 小板源性生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor， PDGFR），具有良好的抗血管生成和抗肿瘤作用[177，178]。目前在动物模型中发现这两者均能抑制HSOS的发展[179，180]。

在MCT诱导的HSOS动物模型中，预防性索拉菲尼给药能减轻肝组织病变和肝功能损害[179]。虽然索拉菲尼不能改善LSEC早期细胞骨架解聚引起的形态改变，但能维持LSEC和Disse间隙的附着并延缓LSEC的脱落，从而缓解晚期窦道的阻塞。通过免疫组织化学也能确定索拉菲尼能减轻MCT对LSEC的损伤，而且肝脏MMP-9的活性受到抑制；索拉菲尼可能是通过抑制VEGF/JNK/MMP-9通路减轻HSOS；另外索拉菲尼可以提高肝切除生存率，因此索拉菲尼可能更适合那些需要围手术期化疗和准备肝癌肝切除的病人，例如：结直肠癌肝转移（colorectal liver metastasis， CRLM）并需要奥沙利铂化疗具有罹患HSOS高风险的患者[179]，但由于二期临床研究发现：索拉菲尼与奥沙利铂联用并不能明显提升转移性结直肠癌患者的无进展生存时间和生存率，因此索拉菲尼应用受限[181]。在动物模型中，瑞格拉菲尼具有减轻肝脏病理损伤、减轻LSEC损伤、减轻肝切除后HSOS加剧的病理损伤和提升肝切除存活率等作用，但作用机制可能是抑制胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinase， ERK）/MMP-9相关信号通路的激活[180]。瑞格拉菲尼作为新药，比索拉菲尼具有更强的抑制血管生成、细胞增殖、促进凋亡和抗肿瘤的作用[177]。临床研究表明，与标准疗法瑞格拉菲尼相比，能显著改善转移性结直肠癌患者的生存率和疾病无恶化期[182]。因此瑞格拉菲尼可能对CRLM相关化疗患者更有应用前景。

3.2.3 磷酸二酯酶III抑制剂

奥普力农（Olprinone， OLP）和西洛他唑（Cilostazol， CZ）是两种特异性的磷酸二酯酶抑制剂，据报道有抑制HSOS的作用[140，183]。动物模型中，OLP预防给药可以通过诱导HO-1表达、激活Akt通路，从而促进LSEC的保护作用而抑制HSOS的发展，实验中表现为RECA-1蛋白表达维持在一定水平以及抑制HSOS特征性病理改变和血清肝酶的上升。而且OLP可提升肝切除后个体的存活率，可能也是治疗CRLM的潜在药物[183]。Takashi等人认为血小板在血管腔外的Disse间隙中聚集是介导HSOS损伤的重要因素，因此研究了具有内皮保护作用和抗血小板聚集功能的磷酸二酯酶抑制剂CZ对HSOS的效果。实验结果表明：CZ预给药有效减轻组织病理改变，减少EPA形成，同时可能抑制内皮细胞的损伤和血小板激活而导致其标志物PAI-1的表达下调，起到有效预防HSOS的作用[140]。但目前为止这两种药物均无相关HSOS临床实验数据，且与多种诱导该病的化疗药物之间的相互作用仍不清楚，尚待进一步研究。

3.2.4 重组人血栓调节蛋白 (rTM)

重组人血栓调节蛋白(recombinant human throm- bomodulin， rTM) 是一种临床全新的治疗弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation， DIC）的药物，可通过结合凝血酶阻止凝血。由于DIC病理机制与HSOS较为类似，因此有了将rTM用于治疗HSOS的尝试[184]。大鼠模型中，rTM预防给药可能通过减少循环中的高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein 1， HMGB1）从而抑制相关通路的激活，减轻HSOS症状和组织损伤，保护LSEC，抑制中性粒细胞的累积和氧化应激。而且rTM也能减轻肝切除手术诱导的HSOS恶化，提高术后生存率，也有CRLM应用前景[185]。而在小鼠模型中，利用流式细胞术发现rTM能下调MCT处理后的LSEC细胞损伤相关基因以及维持编码eNOS的基因表达从而保护LSEC[186]。而且同一课题组的另一篇文章发现rTM能上调肝组织eNOS的表达，下调PAI-1水平。rTM预给药通过抑制EPA和抑制LSEC的脱落和破坏从而对抗HSOS的发展[187]。在体外实验中rTM也被证明具有对内皮细胞的保护作用，这种作用可能是通过血栓调节蛋白第五表皮生长因子样结构域的C环（C Loop of fifth epidermal growth factor-like domain of thrombomodulin， TME5C）作用于细胞表面G蛋白偶联受体15 (G protein-coupled receptor 15， GPR15)介导的[186，188]。此外，一项 41例使用rTM治疗HSOS的临床样本与DF治疗效果比较的临床实验证明rTM的治疗效果与DF相近[184]。这让rTM成为继DF后最有希望成为治疗HSOS的常规临床药物。

3.2.5 甘草素和甘草苷

甘草素和甘草苷是传统中草药甘草的两种主要活性成分，研究表明甘草素能通过恢复肝脏GSH含量抵御药物诱导的肝损伤，并且甘草素和甘草苷可以减轻环磷酰胺诱导的小鼠LSECs损伤和炎症损伤[189，190]。目前的动物研究表明：甘草素和甘草苷可以通过减少HSP60下调其下游的TLR4 / NFκB炎症通路，以及通过作用于Nrf2和keap1蛋白结合位点促进其解离诱导Nrf2核转位激活上调Nrf2下游抗氧化应激通路。在这两条通路的共同作用下减轻肝脏炎症损伤和氧化应激损伤从而削弱HSOS病情[143，147]。由于甘草素和甘草苷具有较高的安全性，因此非常有潜力用于临床HSOS治疗，但仍缺乏临床研究数据。

3.2.6 其他药物

其他对HSOS有保护作用的药物作用机制研究大多与抗氧化应激、抗炎症损伤、保护LSEC、下调MMP-9等作用有关[126，142，145，191-196]。当然也有一些其他通路的参与，如凝血-纤溶相关通路、PI3K和MAPKs 等[142，145]（具体药物及其作用机制见表2）。也有关于血液成分疗效的研究，如人脐带源性内皮集落形成细胞（human umbilical cord-derived endothelial colony forming cells， hUC-ECFCs）可以在趋化因子的驱动下迁移至损伤部位增殖分化为功能内皮细胞修复组织损伤从而减轻HSOS[197]。还有实验证明血小板对HSOS有防治作用，给予TPO或TPO激动剂能增加肝内血小板数量，能保护LSEC、下调MMP-9表达从而减轻肝脏损伤，这可能是因为充足数量的血小板会封住HSOS产生的内皮缝隙，阻止血液成分进一步进入Disse间隙介导的损伤[198]。与此前EPA参与介导了HSOS损伤的理论一致[133，139]。GSH和MMP抑制剂对HSOS的保护作用虽然很早就被发现，但始终没有在临床得到很好的验证[126，195]。

表2 预防和治疗HSOS临床前研究的药物Tab.2 Drugs of preclinical research for prevention and treatment of HSOS

4 总结与展望

本文综述了LSEC的功能及在HSOS发病机制中的作用，总结了近年来发现的有希望防治HSOS的相关方法。由于FDA唯一批准的临床药物DF价格昂贵和不易获得，难以大范围应用于临床，因此迫切需要寻找治疗HSOS的临床新药。阐明HSOS的发病机制有利于制定治疗策略和开展新药研究。迄今发现的药物虽然大部分尚未开展临床应用研究，但在HSOS动物模型中取得了良好的治疗效果。这些药物对HSOS的保护作用多与抗氧化应激、抗炎、内皮保护以及抑制MMP等机制有关，以LSEC为靶点、有针对性地研发HSOS防治新药仍是今后的方向。