外泌体产生的生物学效应对眼部疾病的作用及治疗应用

李映雪，付燕，童瑶，杨路*

（1宁波大学医学院附属医院眼科；2宁波大学附属人民医院眼科，宁波 315000）

外泌体（exosome）是一类通过细胞膜内陷形成早期内体（endosome），随后在转运复合体及一些相关蛋白的调控下出芽形成多囊泡体（multivesicular bodies， MVB），经外膜与细胞膜融合后，继而分泌到胞外的脂质双分子层小囊泡，直径30～150nm，属于细胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）的一种[1]。在细胞分泌后，外泌体可充当细胞信号的媒介，将其“货物”—mRNA或miRNA等输送到受体细胞中，参与细胞间遗传信息的传递与基因表达的调控。除参与细胞间通讯外，外泌体还具有调控细胞的增殖与凋亡、免疫应答、细胞外基质转换、干细胞分裂或分化、新生血管和细胞废物去除等作用[2]。近年来，随着对各种细胞分泌的外泌体深入探究，发现外泌体可应用于疾病的早期诊断、药物的递送及疾病的治疗等多方面[3]。在眼科方面，已发现外泌体可用于治疗视神经挤压伤、青光眼、视网膜缺血、视网膜激光损伤、自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变等疾病[4]。外泌体作用的多样性是由于，当环境发生变化或周围的细胞状态影响其成分组成时，可释放具有独特成分的不同外泌体亚群[5]，可利用差异表达的蛋白或其它因子从而对受体细胞产生不同的调节作用。下面概述几种不同的细胞在不同环境条件下分泌的外泌体的作用与功能。

1 视网膜色素上皮细胞来源的外泌体及功能

视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium， RPE）是一种分隔脉络膜和光感受器的单细胞层，在视觉稳态中起关键作用。由于其解剖位置的特殊性，RPE容易受到氧化应激造成细胞损伤，特别是活性氧（ROS）的刺激。

1.1 RPE源性外泌体诱导新生血管产生

多项研究发现，氧化应激可使RPE细胞分泌的外泌体增多，内皮细胞在外泌体的影响下成管能力增加，眼底新血管形成因此加速。新生血管广泛生长且自身无收缩止血功能，因此视网膜内非常容易出血，进而发展出现纤维增生，引起玻璃体积血、视网膜增殖、牵拉性视网膜脱离等，是导致患者视力急剧下降，最终失明的主要原因。因此新生血管是致盲性疾病，如湿性老年性黄斑变性（age-related macular degeneration， AMD）和糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy， DR）最常见的标志之一。有研究表明，外泌体无论在体外和体内都具有独立的血管生成活性，在探究其促进新生血管产生的机制时发现，受氧化应激刺激的人视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞的外泌体中血管生成因子受体(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)的表达显著升高，并包裹额外的miRNAs[6]。关于miRNAs对新生血管的影响，有研究表明miR-543富集的外泌体可显著诱导受体RPE细胞的上皮间充质转化（EMT）[7]，发生EMT的RPE细胞所分泌的外泌体较正常RPE细胞分泌的外泌体含有更多的血管生成因子，且miR-543、miR-10a-5p和miR-323a-3p的水平显著提高，由此加重EMT循环。此外异常miR-155的递送也可使ARPE-19细胞促血管生成[8]。但外泌体也并不仅仅是形成新血管的帮凶，如脊索细胞分泌的外泌体可将高表达的miRNA-140-5p转移到内皮细胞并调节下游Wnt/β-catenin通路来抑制血管生成[9]，也可产生治疗作用。

1.2 RPE源性外泌体参与免疫调节

除了通过miRNAs诱导新生血管，外泌体作为目前最具特征的细胞外囊泡（EVs），也因其体外和体内免疫调节活性而闻名，且其免疫调节潜力与细胞来源无关[10]。因此在探究RPE细胞中具有的多种免疫特性时， Knickelbein等[11]认为细胞分泌的EVs可能是这些免疫调节功能的中介，通过证明发现RPE细胞衍生的外泌体根据炎症环境差异调节T细胞反应和单核细胞表型。当在稳态条件下分泌的外泌体可促进人单核细胞CD14+CD16+的免疫调节表型增加；在受炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ和TNFα等的刺激下外泌体可诱导多种促炎细胞因子的上调和单核细胞死亡，由此可以看出细胞周围环境的变化会改变其分泌的外泌体的免疫活性。此外，补体系统作为先天免疫系统的主要组成部分，细胞可通过补体因子H（complement factor H， CFH）或通过CD46和CD59等细胞膜分子，来保护自己免受过度的补体激活，但有研究发现在AMD中CD46和CD59减少[12]。Ebrahimi等[13]发现这是由于AMD中Bruch膜中存在的氧化低密度脂蛋白（oxLDLs）的影响，使RPE细胞中的CD46和CD59通过在外泌体和凋亡颗粒中释放而部分降低，从而使RPE细胞对补体介导的损伤敏感。除了AMD，外泌体在干燥综合征（sjogren syndrome， SS）干眼、角膜移植排斥反应、自身免疫性葡萄膜炎等几种眼睛疾病中也发挥免疫调节作用[14]。

1.3 RPE源性外泌体抑制细胞凋亡

αB-晶状体蛋白（αB-crystallin）被称为细胞内高尔基膜相关的小热休克蛋白。Gangalum等发现αB-晶状体蛋白通过外泌体从ARPE-19细胞分泌，而该蛋白又可通过内吞途径中的一个分支点对外泌体合成或分泌起调节作用[15]。αB-晶状体蛋白是一种具有抗凋亡活性的伴侣蛋白，在保护视网膜色素上皮细胞免受氧化应激敏感性增加方面发挥重要作用。这是由于当RPE细胞受到氧化和内质网应激的刺激，会对外源性αB-晶状体蛋白的摄取增加，并通过抑制Caspase-3和多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase， PARP）的激活来保护细胞免于凋亡，从而在眼部起到神经保护作用[16]。但由于αB-晶状体蛋白体积小，达到治疗效果需要一个巨大的释放量，Wang等[17]将αB-晶状体蛋白肽设计成蛋白质聚合物纳米颗粒，通过调节其流体力学半径来增强效力。其他研究也同样发现其纳米囊化形式可以为各种视网膜退行性、炎症和血管疾病（如AMD和DR）提供极大的治疗优势[18]，且与其相互调节的外泌体或许是最好的形式[19]。

2 间充质干细胞来源的外泌体及功能

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新能力、分化可塑性、神经营养特性和免疫调节特性，是治疗神经系统疾病方面最有前途的外泌体细胞来源[20]。

2.1 MSC源性外泌体提供视神经保护

多项研究已表明，MSC衍生外泌体在促进中枢神经系统（CNS）神经元的保护和再生方面已显示出显著的治疗效果[21]，骨髓间充质干细胞（BMSCs） EVs甚至可作为一种有效的神经保护疗法，用于慢性高眼压模型的治疗。Mathew等[22]也研究发现视网膜神经元、视网膜神经节细胞和小胶质细胞都能接受EVs，因此在视网膜疾病神经保护和再生治疗方面十分有潜力。例如，在创伤性（视神经挤压伤）和退行性（青光眼）眼病中，视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell， RGC）及其轴突的丢失是导致失明的主要原因之一，而Mead等[23]发现BMSC来源的外泌体可促进RGC的存活和轴突的再生，同时防止RGC轴突丢失和RGC功能障碍；通过敲除关键的miRNA效应分子Argonaute-2后发现外泌体依赖于miRNA在视网膜内层发挥治疗作用，其疗效可通过损伤视网膜的信号如TNFα启动和增加PEDF及VEGF-AA水平进一步提高[24]。

2.2 MSC源性外泌体减轻炎症反应

此外，MSCs可以抑制T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和树突状细胞等的增殖和功能，促进调节性T细胞增殖，被认为是治疗自身免疫性和炎症性疾病的潜在新药物[25]。研究表明，MSC的免疫抑制作用主要归因于其衍生的细胞外囊泡（MSC-EVs）的影响，这是由于其抗炎作用主要靠MSC-EVs传递免疫细胞中的miRNAs和蛋白来完成，因此在局部和全身应用MSC-EVs后能有效抑制炎症组织的有害免疫反应，促进损伤实质细胞的存活和再生[26]。MSC-EVs不仅能抑制抗原提呈细胞的活化，抑制Th1和Th17细胞的发育[27]，还能抑制炎症细胞的迁移[28]，因此可以对自身免疫性葡萄膜炎和视网膜炎性疾病中发挥治疗作用。如Zhang等发现miR-126高表达的间充质干细胞衍生的外泌体（MSC-Exos）可显著降低高糖诱导的HMGB1表达和NLRP3炎症小体在人视网膜内皮细胞（human retinal endothelial cells， HRECs）中的活性，减轻高血糖所致的视网膜炎症[29]；MSC-Exos玻璃体腔注射治疗后，视网膜单核细胞趋化蛋白(MCP)-1明显下调，促进视网膜激光损伤的恢复[30]。而且有趣的是，只有在接受MSC衍生外泌体的动物中才注意到炎症减轻作用，在使用成纤维细胞衍生外泌体治疗后没有效果[31]，因此证实不同细胞来源的外泌体作用并不相同。

3 角膜细胞与睫状体细胞来源的外泌体及功能

3.1 角膜细胞源性外泌体促进伤口愈合

角膜伤口的愈合需要经过上皮细胞增殖和迁移、基质细胞死亡、角膜细胞增殖、肌成纤维细胞生成、胶原沉积和炎症细胞浸润等多个过程[32]，因此角膜上皮与基质间的相互作用对于角膜伤口的愈合来说尤为重要。而有研究发现能穿透厚厚的内皮基质膜（Descemet膜）的外泌体似乎是角膜上皮与基质之间“沟通”的重要介质。例如，Zieske等[33]发现从角膜上皮细胞中分离出的EVs可直接导致角膜细胞启动纤维化。并且Lai等[34]发现用血栓素-1（thrombospondin-1， TSP-1）处理的人角膜上皮细胞（human corneal epithelial cells， HCECs）中 分 离出的外泌体含有伤口愈合相关蛋白，这些外泌体被HCECs吸收后可促进组织的重塑与修复。而角膜细胞中除了角膜上皮细胞外，研究发现人角膜间充质干细胞也可以分泌外泌体并能加速角膜上皮伤口愈合[35]。例如，角膜基质干细胞（corneal stromal stem cells， CSSC）的间充质干细胞可防止角膜损伤后纤维瘢痕形成，刺激透明基质组织的再生。Shojaati等[36]发现这是由于CSSC EVs与角膜上皮和基质细胞迅速融合后，将miRNA转移到靶细胞，从而降低纤维基因Col3a1和Acta2的表达，阻断中性粒细胞的浸润，从而恢复正常组织形态；而当减少EVs的miRNA时，对阻断角膜瘢痕的形成无效。另外Wang 等[37]发现诱导多能干细胞衍生外泌体（iPSCs-Exos）可以增加HCECs的迁移和增殖，抑制多种损伤引起的细胞死亡，并且MSC-Exos治疗角膜上皮缺损的疗效强得多。多种发现均反映了外泌体等细胞外囊泡对于角膜伤口愈合的重要性。

3.2 非色素睫状体上皮源性外泌体调节Wnt通路

眼压的控制取决于主要由非色素睫状体上皮（non-pigmented ciliary epithelium， NPCE）细胞产生的房水与其通过传统和替代途径流出之间的动态平衡。而传统流出途径中，存在于小梁网状细胞中典型Wnt信号通路，是房水流出和眼压的关键调节因子，与青光眼的发病机制密切相关[38]。Lerner 等[39]发现NPCE细胞分泌的外泌体通过下调GSKβ正调节因子AKT的表达和增加GSKβ负调节因子PP2A的水平，使GSK3β磷酸化减弱和β-catenin的胞质水平降低，此外，Wnt信号通路的负调节因子miR-29b在NPCE外泌体中也含量丰富，从而干扰 Wnt 信号传导途径，使小梁网中细胞外基质（ECM）重塑，沉积到小梁网状细胞的多孔结构中，减少房水的流出，导致眼压升高。有意思的是，Tabak 等[40]发现Wnt信号相关蛋白的表达下调不仅与外泌体相关，而且与外泌体的浓度相关，只有在低浓度外泌体的刺激下才能有效调节Wnt信号相关蛋白的表达。因此，NPCE衍生的外泌体参与调节的信号通路或许可以作为引流系统内药物干预的新靶点，即青光眼治疗的靶点[41]。

4 外泌体未来在眼病中的应用与展望

如前所述，外泌体与多种眼部疾病的发生和发展关系密切，虽然目前在眼病治疗的研究方面还处于起步与探索阶段，但从肿瘤与神经系统疾病方面的研究中不难发现，外泌体在眼部疾病的早期诊断和治疗中潜力巨大。

外泌体因其相对稳固性，可以通过多种方法从泪液、房水、玻璃体液中获取，又因包含组织、细胞或疾病特异性的蛋白质和核酸，其在眼部疾病诊断方面的应用前景颇为看好[42]。关于疾病治疗，在角膜干细胞缺乏、角膜损伤等眼表疾病中，外泌体介导的旁分泌由于其无细胞性质，可以规避干细胞移植的局限性和风险，减少自身免疫和排斥反应，使外泌体通过基因修饰可获得最佳的治疗亲和力[43]。此外，许多视力威胁性疾病，如年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病影响眼睛的后段，由于眼睛的特殊解剖和生理，受血-视网膜屏障的保护，为药物输送到视网膜提出了一个重大挑战。而外泌体作为一种天然的纳米药物载体，具有与脂质体相似的穿梭亲脂性和亲水性货物的能力，能够跨越血脑屏障[44]，将其包裹的分子传递到细胞膜上，并且与合成纳米材料相比，不仅药物清除率降低，在靶向、安全和药代动力学方面都显示出实质性的好处[45]。而目前，虽然外泌体的优点已广被熟知，但离实际的临床应用还很遥远，外泌体存在的问题也需要多多被探究，以期望在未来发挥安全的治疗效用。