血液中酒精含量检测方法及标准物质研究进展*

宋增良，冯金淼，郭 硕，王晓冰

(河北省计量监督检测研究院，河北 石家庄 050227)

酒精含量是指车辆驾驶人员血液或呼气中的酒精浓度[1]。近年来，随着城镇化进程加快和机动车保有量的日益增加，道路上的交通事故频发，酒后驾驶已成为发生恶性交通肇事的主要原因[2]。2011年5月1日生效的《刑法修正案(八)》将醉酒驾驶规定为犯罪并予以相应的刑事处罚，这一强制手段为减少因饮酒导致交通事故，规范驾驶机动车，维护交通安全，起到积极作用。血液中酒精含量检测是危险驾驶定罪、量刑的主要依据[3]，司法部司法鉴定管理局规定检测时，统一按照国家标准GB19522，采用GA/T1073或GA/T842规定的方法进行。

检测血液中酒精含量需以有证标准物质作为参考标准，才能在不同的时间和空间内对物质的统一特性进行有效测量，并能对测量结果进行比较，保证测量结果的可比性和有效性。本文介绍了血液中酒精含量的检测方法及检测用标准物质的研究进展，为今后判定车辆驾驶人员是否酒后或醉酒后驾车提供参考借鉴。

1 血液中酒精含量检验方法研究

常用检测血液中酒精含量的方法主要有化学法、酶法和气相色谱法等[4-6]。

1.1 化学法

化学法主要包括酸性条件重铬酸钾氧化分光光度法，原理为：重铬酸钾—硫酸溶液与血液中酒精发生氧化还原反应，酒精在酸性条件下被重铬酸盐氧化，其浓度与重铬酸盐还原量呈正相关，通过测定重铬酸盐的反应量计算酒精含量。左保林[4]利用酸性条件重铬酸钾氧化分光光度法测定血液中酒精含量，以三氯乙酸为蛋白沉淀剂，4000 rpm离心样品，上清液经重铬酸钾—硫酸溶液氧化，使用紫外可见分光光度计测定595 nm处吸光度值，结果表明0～600 μg/100 mL线性范围时，血液中酒精浓度线性关系：Y=0.38X+0.044(r=0.9952)。用化学法检测血液中酒精含量不需精密仪器，操作简便，成本低，易普及。但检测过程中灵敏度低，易受外界因素影响，准确性低，此方法正逐渐被替代。

1.2 酶 法

酶法目前已被广泛使用，其原理是模拟酒精在肝脏中氧化的过程，以三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸为缓冲体系，酒精被乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶催化产生还原型辅酶，在340 nm波长处还原型辅酶有特殊吸收峰，通过分光光度计测定340 nm处还原型辅酶吸收率，间接计算酒精含量。胡云良等[7]利用酶法测定血液中酒精含量，以Tris-HCl缓冲液为反应条件，使用自动生化分析仪对其进行两点终点法检测，结果表明在200～1200 mg/L线性范围时，血液中酒精浓度线性关系：Y=0.997X-3.2(r=0.998)；方法精密度：低浓度和高浓度批内变异系数分别为2.8%、2.5%，批间变异系数分别为3.9%、3.3%；回收率：99.8%，胆红素(低于159.1 μmol/L)、甘油三酯(低于7.4 mmol/L)、血红蛋白(低于11.6 g/L)、乙醛(低于0.3 g/L)、异丙醇(低于0.2 g/L)、甲醇(低于0.7 g/L)、甲醛(低于0.6 g/L)时，对检测结果无明显影响；酶法与气相色谱法比较，线性关系：Y=0.993X-9.76(r=0.998)。酶法检测血液中酒精含量不需使用蛋白沉淀剂去除蛋白，操作简便，灵敏度相对较高，但还原型辅酶无特异性，检测结果易受血液中含烃基等化合物干扰。

1.3 气相色谱法

用气相色谱法检测血液中酒精含量，灵敏度高，定量精准，可检测出10-9甚至10-13级酒精含量，速度快且自动化程度高，适用于分析易挥发有机物。检测时一般选用氢火焰离子化检测器，按照不同方法的前处理，分为直接进样法和顶空气相色谱法。

直接进样法原理为使用蛋白质沉淀剂将血液蛋白凝固，离心，用气相色谱仪-氢火焰离子化检测器对上清液进行检测，以醇类标准为平行操作，保留时间进行定性，用内标以醇对内标物峰面积比定量。

代娟等[8]利用样品直接进入毛细管柱气相色谱，内标法定量，测定血液中酒精含量，为有效去除蛋白，以5%偏磷酸为蛋白沉淀剂，12000 rpm离心样品，结果表明浓度为20～160 mg/100 mL线性范围时，最低检出限：5 mg/100 mL，血液中酒精浓度线性关系：Y=0.032X-0.0667(r=0.9965)。解润芳等[9]依据同样进样方法，内标法定量，以硫酸铝钾为蛋白沉淀剂，2500 rpm离心样品，结果表明浓度为0.2～1.4 mg/mL线性范围时，最低检测限：0.01 mg/mL，血液中酒精浓度线性关系：Y=1.03357X-0.04114(r=0.9993)。气相色谱直接进样法前处理操作简单，检测时间短，灵敏度高，特异性好，能准确分离血液中酒精并精确定量，但Wasfi等[10]研究表明直接进样易使血液蛋白堵塞色谱柱小孔和加样器针头，影响色谱柱使用寿命，此方法正逐渐被顶空进样色谱法替代。

顶空进样色谱法原理为气相色谱仪与顶空进样器联用，将样品直接置于顶空瓶内，恒温加热，使用氢火焰离子化检测器，以叔丁醇为内标，通过保留时间定性，峰面积定量来分析血液中酒精含量。

张伟等[11]利用顶空气相色谱，内标法定量，测定血液中酒精含量，结果表明浓度为10～400 mg/100 mL范围时线性良好，最低检出限：0.25 mg/100 mL，方法准确性：低浓度和高浓度回收率分别为94.70%、99.26%，方法精密度：低浓度和高浓度相对标准偏差(分别为3.6%、4.3%)均小于5%，说明该方法结果准确。欧阳运富[12]等依据同样进样方法，内标法定量，测定血液中酒精含量，结果表明浓度为10～4000 mg/100 mL范围时线性良好，最低检出限：3 mg/L，血液中酒精浓度线性关系：Y=0.0047X-0.0324(r=0.9993)，方法准确性：加标质量浓度分别为200 mg/L、800 mg/L、2000 mg/L回收率范围为98.6%～103%，方法精密度：相对标准偏差范围为1.8%～3.0%，小于5%，说明该方法结果准确。顶空进样色谱法作为检测血液中酒精浓度的标准方法[13-15]，可直接将易挥发气体进入色谱仪，背景简单，检测速度快，且能准确定量，稳定性好，自动化程度高，简单易行，但顶空气相色谱法对仪器配置和实验室条件有较高要求。

2 血液中酒精含量检测用标准物质研究

为使测量结果有效可靠，不同机构间血液中酒精浓度的结果具有可比性，必然要用有证标准物质。在分析过程中以有证标准物质作为参考标准，才能在不同的时间和空间内对物质的统一特性进行有效测量，并能对测量结果进行比较，保证测量结果的可比性和有效性。因此，研究相应的标准物质相当必要。

目前国内有河南省计量工程技术研究中心和中国计量科学研究院研制了血液中酒精含量检测用标准物质即水中乙醇溶液标准物质，其中赵迎晨等[16]采用重量-容量法，配制了0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL、4.00 mg/mL 8种水中乙醇系列浓度标准物质，采用顶空进样气相色谱，进行均匀性、稳定性检验，验证定值结果并评估不确定度。测量结果均匀性检验使用单因素方差分析法，0.105 mg/mL、0.203 mg/mL、0.500 mg/mL、0.801 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL、4.00 mg/mL水中乙醇溶液标准物质均匀性检验数据统计量分别为1.38、1.47、1.00、1.51、1.53、0.83、1.89、0.75，均小于临界值2.30，标准物质在95%置信区间内均匀性良好；长期稳定性采用先密后疏原则，在4℃储存条件考察，经验模型为直线模型，一年内量值无明显变化趋势且稳定性良好，数据均小于2.78；考察(60±5) ℃短期稳定性作为运输过程中受温度影响因素，数据均小于3.18，合格。

3 结 语

血液中酒精含量检测是危险驾驶定罪、量刑的主要依据。上述检测方法中，化学法操作简单，易普及，但灵敏度低、还原性物质易影响准确度；酶法预处理过程少，检测时间短，但易受反应温度、人体内其他化合物影响；直接进样气相色谱法前处理操作简单，检测时间短，灵敏度高，但血液蛋白易使色谱柱小孔和加样器针头堵塞，影响色谱柱使用寿命；顶空气相色谱法直接将易挥发气体进入色谱仪，检测速度快，灵敏度高，准确，精密度高，因此被广泛应用，但顶空气相色谱法对仪器配置和实验室条件有较高要求。

血液中酒精含量检测用标准物质使检测结果有效可靠，不同机构检测结果具有可比性。以有证标准物质为参考标准，才能在不同时间和空间内对物质统一特性进行有效测量，保证结果的可比性和有效性。因此，研究相应的标准物质相当必要。