硒的形态分析方法综述*

成 立，胡 良，刘 瑜，钟智遥，樊后保，熊润国，江栩昱，邹云涛，王香莲，胡盛明

(1 南昌工程学院江西省退化生态系统修复与流域生态水文重点实验室，江西 南昌 330099;2 江西生物科技职业学院， 江西 南昌 330200)

硒是人体内必不可少的微量元素之一，具有重要的生物学功能。弄清硒的功能和生物效应是阐明硒功能和毒理机制的一个关键因素。而硒的生物效应、代谢行为和生物利用率在很大程度上取决于其具体化学形态，元素形态分析是对被分析物中实际存在的化学形式进行识别和定量[1-2]。元素形态分析包括两方面的技术，一是元素化学形式的分离方法，另一是检测方法。近年来，高效液相色谱或电泳与高灵敏度的检测器(比如ICP-MS)结合的联用技术已经表明是最为有效的分析方法[ 3]。ICP-MS在硒形态分析中以灵敏度高，与其他色谱分离技术易结合，干扰少著称，所以应用最广泛[4-5]。

环境和生物样品中硒形态的定性和定量分析包括许多重要的步骤，这取决于样品的基体组成，在分析过程中必须充分考虑这些因素。这些步骤包括：采样、样品储存、样品前处理(包括提取、基体分离、浓缩)、形态分离、测定(包括校正和定量)。每一步都有可能影响整个分析过程中的准确性和对各形态的识别和鉴定，且每一步都需优化、综合考虑其他步骤以达到分析最佳化。

1 采样和样品提取方法

采样方面包括收集、加工和处理，样品分离方法的选择取决于各方面的因素，比如分离和测定的的仪器，且更取决于待分析物的外观形态和基体效应以及样品中可能出现的形态等等。硒形态分析应用已逐渐从环境转向了生物样品，最大的挑战就是尽可能从这些复杂的基体样品中提取原始样品形态且获得高回收率。比如，硒氨基酸是水溶性酸，用热水浸提法可获得足够的回收率。硒代氨基酸可通过超滤和透析而达到提取的目的。而硒代半胱氨酸和一些其他的硒氨基酸不稳定易降解，需选择更有效的提取方法，因为硒比硫在相对应位置上有较低的氧化电势电位。

2 分离方法

分离硒的化合物可通过色谱和电泳等分离方法完成。分离能力和与ICP-MS接口的兼容性是选择分离方法的重要标准。对于小分子的无机硒、小分子代谢物、氨基酸或多肽化合物，反相色谱是最强大的分离方法。

2.1 排阻色谱

空间排阻色谱法适合分离大分子化合物，比如蛋白、高分子材料、肽键等[6]。铁梅等利用体积排阻色谱检测出了富硒金针菇中三种硒多糖，结果验证了硒参与了生物大分子的合成，具有重要的生物活性[7]。肖俊超等采用体积排阻色谱分析了藻细胞中的三种硒结合形态，研究了硒胁迫对小球藻抗氧化酶活性的影响[8]。

2.2 离子交换色谱

离子交换色谱由待分析物的离子和流动相的离子与柱子上的固定相竞争结合而产生分离。离子交换色谱可以分离无机离子和任何易解离的物质[9-10]。胡良等采用阴离子交换色谱法成功测定血清中的SeCys、SeMet、Se(IV)和Se(VI)等小分子硒形态，并应用于研究长期汞暴露地区硒干预人群中血清的硒形态分析研究[9]。

2.3 反相色谱和反相离子对色谱

反相色谱是高效液相色谱中应用最广泛的分离方法，色谱柱效高、分离能力强、保留机理清楚，一般是十八烷基、C18或C8辛基链结合某种固体材料、微孔硅胶材料。由于流动相是单极的，因此样品被流动相和固定相分隔开。戊烷阴离子作为离子对试剂可分离三甲基硒离子、硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。通常情况下，反相离子对色谱与质谱联用时会带来光谱或非光谱的干扰。首先，有机溶剂的使用会增加来自碳氢化合物的光谱方面的干扰，因为会增加背景信号。其次，梯度洗脱越来越普遍，但也会给ICP-MS带来严重的基体干扰信号，所以定量分析变得越来越复杂。

2.4 亲合色谱

亲合色谱与电感耦合等离子体质谱联用可以分析血清中常见蛋白(谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、Sel-P、Se-Albumin)的含量，亲合色谱具有更好的效果，通过亲合色谱微柱和低检测限的ICP-MS联用，优化和改进雾化器效率和流动相的组成，可以分析出微升级样品中的硒蛋白P和硒的其它形态[11]。

2.5 电泳技术

电泳技术是基于离子的电泳淌度不同而实现分离的，它有区带、等速电泳和等电子聚焦三种基本模式。它常用于分离相对稳定的形态，分辨率高，一般和灵敏度极高的检测器比如ICP-MS联用[12]。黄峰等采用SDS-PAGE电泳技术实现了富硒螺旋藻中总蛋白的分离，并利用ICP-MS精测测定各分子量蛋白质中的硒含量[13]。

2.6 多维分离方法

硒形态分析也可以先通过多维色谱分离纯化后，再串联质谱对硒进行定量分析。根据电荷大小及极性它们还可以通过阴离子交换色谱分离成更小的蛋白组分，而未分离的阳离子和不带电的中性化合物需要进一步通过阳离子交换色谱分离，通过二维或三维分离的化合物可通过四极杆或TOF质谱测定[14-15]。

3 定量方法

3.1 色谱定量

色谱法是根据色谱峰的面积或高度进行定量分析的。色谱定量计算方法很多，目前比较广泛应用的有归一化法、内标法和外标法。

3.2 ICP-MS定量测定硒形态

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)具有灵敏度高、图谱简单、检出限低、线性范围宽，能同时进行多元素分析和同位素分析的优点。一般情况下，可通过用混合气体(氙，氦等)，优化调节质谱条件(比如低压，冷却)或利用减少多原子离子干扰的提取镜等方法，来使干扰降到最小。当它用来作为色谱检测器测量分离前的总硒时，多原子离子干扰不容易产生。研究表明，用甲烷作反应气，ICP-DRC-MS作为检测器成功应用于分析硒的六种同位素[16]。大约可以消除氩的五个数量级的干扰。因此可以通过检测硒的主要同位素80Se来达到较高的灵敏度[16]。 ICP-MS 仪器经历了四极杆质谱仪(ICP-QMS)、高分辨双聚焦质谱仪(HR-ICP-MS)和多接收高分辩双聚焦质谱仪(MC-ICP-MS)三个发展阶段。其分离离子的方式有四极杆、飞行时间和扇形分析器等。飞行时间质谱能够很好的与GC和CE结合，且有着采集数据速度快的特点，所以它在形态分析应用上有着潜在发展空间。用高分辨率质谱和动态反应池(碰撞池)可部分地消除多原子离子干扰。尤其在捕获同位素的短暂信号方面，多接收器比单接收器能获得更高的准确度。为了得到更高的分辨率和减少多原子离子干扰，可应用双聚焦扇形质谱，但增加分辨率的同时，也降低了灵敏度。在灵敏度和分辨率方面，只能妥协折中选择，因为增加灵敏度的同时必会降低分辨率。

3.3 同位素稀释法定量(Isotope dilution analysis(IDA))

根据加入同位素稀释剂的形式，可以将同位素稀释法分为特异示踪模式和非特异示踪模式。特异示踪模式(Species-specific spike)是同位素稀释剂与待测样品先相互混匀后再进行分离和检测的。其应用的前提是样品中的形态和组成是已知的。非特异示踪模式(Species-unspecific spike)，也叫柱后同位素稀释法，首次于Rottman和 Heumann在1994年提出，在这种模式中，稀释剂在待测物质通过高效液相色谱分离后再和分离后的待测样品的不同形态一起进入电感耦合等离子体质谱中进行检测。此后可得到待测元素的不同同位素的时间图谱以及同位素比值图谱，然后通过柱后同位素稀释法公式可将每一时间点的待测元素比值换算成相对应的时间质量流谱图。待测样品中不同形态的浓度含量可通过先算出色谱图中相应峰的峰面积，再与进样量相比得到。

柱后同位素稀释法方程是根据样品和稀释剂中待测元素混合前后质量守恒推导得到的。即由公式Nm=Ns+NSp推算出，虽有文献报道其它形式公式但其原理实质是一样的。其中影响准确测量同位素比率的参数有光谱干扰、仪器的死时间和质量歧视等；影响精确测量同位素比率的参数有离子计数统计、当前待测离子的稳定度和同位素稀释法中随机误差的传递等。

柱后同位素稀释法所加入的同位素稀释剂的化学形态与被分析物种不同。这种测定模式的优点是可以对未知结构化合物进行形态分析，能够准确测定样品中存在的未知化合物的浓度[17]。这是其他定量方法，比如标准加入法所无法比拟的，因为加入的元素形态与被分析的元素形态往往是不能完全一致的，所以它们的化学性质也不会相同。由于ICP-MS的离子源的离子化效率与元素存在的形态无关，因此非特异示踪模式经常与ICP-MS联用来测定各种化合物的浓度[18]。由于硒在人体组织、器官、体液中的作用机理、代谢规律还未完全阐述清楚。故有不少分析工作者长期致力于硒形态分析的研究，近几年来，有较多篇文献报道采用柱后同位素稀释法分析GPx, Sel-P, Albumin中的硒含量，以揭示生物体内不同含硒蛋白中硒元素的分布规律[11]。

4 结 语

在未来的几年，硒形态分析的重要性仍然会快速发展。ICP-MS作为检测方法与HPLC、GC和CE联用因灵敏度高、检则限低必然是首选。最后，进一步鉴别各种不同样品中更多硒的形态将面临更大挑战。为得到更精切的硒蛋白和硒化合物信息，比ICP-MS更灵敏的类似分析技术也将会快速发展成熟。类似电喷雾和表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱技术在硒形态分析中将得到更好的应用与发展。金属蛋白组学领域的生物无机形态分析也是一个重点讨论的话题，在硒形态分析研究中也将成为热点。