基于二代测序技术的etDNA与ctDNA在肺癌合并胸腔积液诊断中的临床价值研究

熊柳冰

广东省惠东县人民医院肿瘤科，广东惠东 516300

随着分子诊断技术以及精准医疗的发展，靶向治疗成为中晚期非小细胞肺癌主要治疗手段[1]。研究发现[2-3]，无非小细胞肺癌驱动基因表皮生长因子受体（EGFR）敏感突变证据的患者即使应用靶向药物治疗，其疗效也相当于安慰剂，可见靶向治疗成功的关键在于精准检测EGFR 基因突变。以往在临床中EGFR 基因突变样本主要是从肿瘤组织中选取，操作较为繁琐，且对患者机体创伤也大，推广受限[4]。近年有学者提出，外周血、胸腔积液存有实性肿瘤组织成分，能够用于EGFR 基因突变检测[5]。本研究选取惠东县人民医院（我院）40例患者进行研究，比较胸腔积液DNA（etDNA）与外周血DNA（ctDNA）检测在肺癌合并胸腔积液诊治中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年5—12月我院收治的40例晚期非小细胞肺癌合并胸腔积液患者为研究对象，其中有男22例，女18例；年龄41～77 岁，平均（65.09±9.74）岁；病理类型：8例肺鳞癌，32例肺腺癌。纳入标准：①经病理组织学活检确诊为原发性非小细胞肺癌；②肺部CT 及胸腔积液细胞学检查证实有恶性胸腔积液；③临床TNM 分期属于Ⅳ期；④自愿接受基因突变检测，签订了同意书。排除标准：①纳入研究前已接受放疗、化疗、靶向治疗；②伴有其他恶性肿瘤病史。本研究获得本院医学伦理委员会审批同意。

1.2 检测方法

1.2.1 收集样本 ①血样本：收集患者清晨空腹肘静脉血3～5 ml，并以2000 r/min 速率进行离心处理10 min，将血细胞与血浆分离，取上层血浆待检；②胸水样本：采集50～100 ml 新鲜胸腔积液作为样本，以2000 r/min 速率进行离心处理10 min，弃掉上清液，取沉淀物质待检；③肿瘤组织样本：在胸腔镜下钳取适量肿瘤组织样本。

1.2.2 样本DNA 提取 ①提取血样本DNA：应用QIAamp DNA Blood Mini Kit 试剂盒（上海联硕生物科技有限公司）提取血浆中的游离DNA，严格按照试剂盒操作；②提取胸腔积液、肿瘤组织DNA：均应用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 试剂盒（北京诺博莱德科技有限公司）提取胸腔积液细胞、肿瘤组织DNA，严格按照试剂盒操作。同时，将提取后的ctDNA、etDNA、tDNA 应用Qubit 分析试剂盒[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]分别进行定量分析。

1.2.3 高通量二代测序检测 采用基于杂交捕获法的二代测序技术检测各样本基因变异序列数目与参考序列数目的比值（AF 值）以及EGFR 基因变异情况，包括点突变、扩增、插入/缺失等，检测平台为NextSeq 500 高通量测序仪及其配套的试剂盒（美国Illumina 公司），严格按照仪器说明书操作。其中，ctDNA 的投入量30～80 ng，检测质控要求：中位测序深度保持在12000×以上，有效测序量≥2000×；etDNA、tDNA 的投入量30～80 ng，检测质控要求：中位测序深度保持在1000×以上，有效测序量200～500×。

1.3 观察指标

①比较40例患者etDNA、ctDNA、tDNA 的AF值差异；②以tDNA 检测出的EGFR 基因突变结果为金标准，分析ctDNA、etDNA 检测EGFR 基因突变的诊断效能。

1.4 统计学方法

应用SPSS 23.0 统计学软件进行分析，计数资料以率描述，经χ2检验；计量资料以（）描述，两组间比较经t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 etDNA、ctDNA、tDNA检测结果比较

40例患者的etDNA 的AF 值较ctDNA 明显升高（P＜0.05），而与tDNA 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 etDNA、ctDNA、tDNA检测结果比较

2.2 etDNA、ctDNA、tDNA检测EGFR基因突变的临床效能分析

以tDNA 检测出的EGFR 基因突变结果为金标准，etDNA 检出EGFR 基因突变的敏感度及准确性明显高于ctDNA 检测（P＜0.05），见表2～3。

表2 etDNA、ctDNA、tDNA检测EGFR基因突变结果

表3 etDNA与ctDNA检测EGFR基因突变的临床效能[%（n/n）]

3 讨论

EGFR 为受体氨酸激酶的一种，主要来源于上皮细胞、间叶细胞中。目前已有大量研究证实[6-7]，EGFR 在恶性肿瘤组织中过度表达，是癌细胞增殖、浸润、转移的主要调节因素。另有研究报道[8]，EGFR 在正常肺组织中不表达或低表达，而在非小细胞肺癌组织中由于基因扩增、过表达等，EGFR 呈高表达。在癌细胞活跃状态下，EGFR 通路异常也被激活，EGFR 活性明显增加，难以抑制肿瘤细胞生长，进一步促进癌灶增殖分化、转移等，故EGFR 为非小细胞肺癌治疗的主要靶分子[9]。研究也发现[10]，准确检测EGFR 基因突变情况严格筛选适合靶向治疗的非小细胞肺癌患者，对于提高疗效具有积极的作用。

在临床上，与靶向治疗有关的DNA 基因突变检测的方法有RT-PCR 定量检测、Sanger 测序等，本研究指出上述方法具有通量较低、检测费用高等不足[11]。研究发现[12]，二代测序技术能够有效解决肿瘤细胞异质性的问题，其检测灵敏度较一代测序技术显著升高，可检测到低至0.1%的低频突变，并可以同时检测多个样本多种基因突变情况，达到深度测序的目的。

在EGFR 基因突变检测的样本来源方面，肿瘤病灶组织为“金标准”，但肿瘤组织取材困难，不利于动态监测靶向治疗后EGFR 基因变异情况，易对患者机体造成创伤[13]。液体活检为一种新兴的基因检测方式，因具有无创、操作简单、便于动态监测等优点而逐渐应用于临床中。血浆、胸腔积液等均属于液体活检范畴。本研究结果发现，40例患者etDNA 的AF 值较ctDNA 明显升高，且以tDNA 检测出的EGFR 基因突变结果为金标准，发现etDNA检出EGFR 基因突变的敏感度及准确性明显高于ctDNA 检测，提示与胸腔积液DNA 检测EGFR 基因突变的诊断效能优于外周血DNA。笔者分析其原因主要是，血浆样本中的肿瘤细胞DNA 片段浓度相对较低，而恶性胸腔积液中含有多肿瘤细胞，其存有的肿瘤细胞DNA 片段浓度相对更高，故选用胸腔积液DNA 检测EGFR 基因突变的敏感度更高[14]。但本研究中，胸水样本与肿瘤组织样本的基因突变检测结果仍有一定的差异，这可能是采集的样本中存有的突变DNA 含量低于监测范围，故其检测假阴性，此外也有可能是肿瘤组织异质性所导致的[15]。

综上，与ctDNA 检测相比，应用二代测序技术检测etDNA 诊断晚期非小细胞肺癌合并胸腔积液的敏感度更高，对于临床早期诊治具有良好的指导性意义，故在实际临床中当肿瘤组织样本获取较为困难时，可选择胸腔积液代替进而EGFR 基因突变检测。